Karınca Harpegnathos tuzlayıcısında CRISPR Aracılı Mutagenez için Embriyo Enjeksiyonları
Summary
Böcek ösosyalliğinin birçok özelliği, koloni içi iletişime ve işbölümüne dayanır. Karınca embriyolarındaki anahtar düzenleyici genlerin mikroenjeksiyon ve CRISPR aracılı mutagenez yoluyla genetik manipülasyonu, ösosyal böceklerde özgecil davranışın doğası hakkında fikir verir.
Abstract
Sosyal davranış ve üreme işbölümü gibi ösosyal böceklerin benzersiz özellikleri, genetik sistemleri tarafından kontrol edilir. Genlerin sosyal özellikleri nasıl düzenlediğini ele almak için, sinsityal aşamalarında genç embriyolara CRISPR kompleksinin verilmesi yoluyla mutant karıncalar geliştirdik. Burada, çarpıcı fenotipik plastisite gösteren bir ponerin karınca türü olan Harpegnathos saltator’da CRISPR aracılı mutagenezinin bir protokolünü sunuyoruz. H. tuzlayıcı karıncalar laboratuvar ortamında kolayca yetiştirilir. Embriyolar, Cas9 proteinleri ile mikroenjeksiyon için toplanır ve ev yapımı kuvars iğneleri kullanılarak in vitro sentezlenmiş küçük kılavuz RNA’lar (sgRNA’lar). Enjeksiyon sonrası embriyolar koloni dışında yetiştirilir. İlk larvaların ortaya çıkmasından sonra, tüm embriyolar ve larvalar, daha fazla gelişme için birkaç hemşirelik çalışanı ile bir yuva kutusuna taşınır. Bu protokol, karıncalarda kasta özgü fizyoloji ve sosyal davranışların analizi için mutagenezi indüklemek için uygundur, ancak daha geniş bir hymenopteran ve diğer böcek spektrumuna da uygulanabilir.
Introduction
Böceklerde ösosyalliğin, yani Hymenoptera ve Blattodea (eski adıyla Isoptera) düzenlerinin evrimi, hem birey hem de koloni seviyelerinde ortaya çıkan benzersiz ve genellikle sofistike davranışsal özelliklerle sonuçlanmıştır. En gelişmiş sosyal böcek gruplarını karakterize eden bir özellik olan üreme işbölümü, genellikle davranışsal ve genellikle morfolojik olarak ayırt edici gruplardan oluşan kast sistemlerini içerir. Kastlar arasındaki bu tür davranışsal ve morfolojik çeşitlilik sadece genetik sistemleri tarafından değil, aynı zamanda çevre 1,2,3,4 tarafından da kontrol edilir ve bu da ösosyal böcekleri genetik ve epigenetik araştırmalar için çekici konular haline getirir.
Ösosyal böceklerin genetik sistemini manipüle etme yeteneğinin, birçok türün laboratuvar ortamlarında çiftleşmediği ve üremediği için zor olduğu kanıtlanmıştır. Çoğu ösosyal böcek ayrıca bir kolonide çok az sayıda üreme bireyine sahiptir, bu da üretilebilecek yavru sayısını sınırlar ve sonuç olarak genetik manipülasyon için örneklem boyutunu sınırlar5. Ek olarak, birçok ösosyal böcek, genetik çalışmalar için yaygın olarak kullanılan böceklere ( Drosophila gibi) kıyasla uzun nesil sürelerine sahiptir ve genetik çizgilerin oluşturulmasının zorluğuna katkıdabulunur 5. Bununla birlikte, bazı ösosyal türler, bir kolonide üreme açısından aktif bireylerin büyük bir bölümünü üretebilir, bu da zorlukları hafifletir ve mutant veya transgenik çizgiler oluşturma fırsatları sunar.
Poperin karınca türü Harpegnathos tuzlayıcısı söz konusu olduğunda, tüm kadın işçiler bir kraliçenin ölümü veya sosyal izolasyon üzerine üreme açısından aktif hale gelebilir. Bu işçilere “gamergates” denir ve yeni koloniler oluşturmak için kullanılabilir6. Ayrıca, bir kolonide birden fazla oyuncu kapısı bulunabilir, böylece yavru üretimi 5,7,8 artar. Şimdiye kadar, Avrupa bal arısı, Apis mellifera ve karınca türlerinde, H. saltator, Ooceraea biroi ve Solenopsis invicta9,10,11,12,13,14,15 mutant ve / veya transgenik çizgiler geliştirilmiştir. . Sosyal arılarda ve karıncalarda yapılan genetik analizler, ösosyalliğin daha iyi anlaşılmasına giden yolu açmış, genleri ve bunların ösosyal böcek davranışı ve kasta özgü fizyoloji üzerindeki etkilerini incelemek için bir dizi fırsat sağlamıştır.
Burada, H. saltator’daki CRISPR / Cas9 sistemi aracılığıyla genetik modifikasyon için bir protokol sağlıyoruz. Spesifik olarak, bu teknik, tüm koku verici reseptörlerin (OR’lar) zorunlu ko-reseptörünü kodlayan gen olan orco’da bir germline mutasyonu oluşturmak için kullanıldı10. OR genleri, hymenopteran eusocial böceklerinde16 önemli ölçüde genleşmiştir ve orko, böcek koku almada önemli bir rol oynamaktadır; yokluğunda, ameliyathaneler normal şekilde toplanmaz veya çalışmaz. Orko geninin mutasyonları bu nedenle koku alma hissini, sinirsel gelişimi ve ilişkili sosyal davranışları bozar 9,10.
Bu protokolde, Cas9 proteinleri ve küçük kılavuz RNA’lar (sgRNA’lar), bir hedef genin mutagenezini indüklemek amacıyla mikroenjeksiyon kullanılarak karınca embriyolarına verilir. Burada, mikroenjeksiyon prosedürünü, kolonilerin ve enjekte edilen embriyoların bakımı ile ilgili talimatlarla birlikte ayrıntılı olarak açıklayacağız. Bu yöntemler, H. tuzlayıcı karıncalarında çeşitli farklı genlerde mutagenezi indüklemek için uygundur ve daha geniş bir hymenopteran böcek spektrumuna uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Karıncalar, arılar, yaban arıları ve termitler de dahil olmak üzere böcekler arasında ösosyalliğin evrimi, birçoğunun çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonundan etkilendiği anlaşılan yeni davranışsal ve morfolojik özelliklerin ortaya çıkmasına neden olmuştur 1,2,3,4. Ne yazık ki, genetik alanında araştırma modelleri olarak ösosyal böceklerin çekiciliği v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Danny Reinberg ve Claude Desplan’ın New York Üniversitesi’ndeki laboratuvarlarına ve Jürgen Liebig’in Arizona Eyalet Üniversitesi’ndeki laboratuvarına karınca genetiği konusundaki destekleri için teşekkür ediyor. Hua Yan, Ulusal Bilim Vakfı I / UCRC’den, IIP-1821914 Hibe No. IIP-1821914 kapsamında Eklembacaklı Yönetim Teknolojileri Merkezi’nden ve endüstri ortaklarından destek aldığını kabul ediyor. Maya Saar, Amerika Birleşik Devletleri – İsrail İki Uluslu Tarımsal Araştırma ve Geliştirme Fonu, Vaadia-BARD Doktora Sonrası Burs No. FI-595-19 tarafından desteklendi.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
