Embryo-injecties voor CRISPR-gemedieerde mutagenese in de mier Harpegnathos saltator
Summary
Veel kenmerken van insectenesocialiteit zijn afhankelijk van communicatie binnen de kolonie en arbeidsverdeling. Genetische manipulatie van belangrijke regulerende genen in mierenembryo’s via micro-injectie en CRISPR-gemedieerde mutagenese geeft inzicht in de aard van altruïstisch gedrag bij eusociale insecten.
Abstract
De unieke eigenschappen van eusociale insecten, zoals sociaal gedrag en reproductieve arbeidsverdeling, worden gecontroleerd door hun genetische systeem. Om aan te pakken hoe genen sociale eigenschappen reguleren, hebben we gemuteerde mieren ontwikkeld via toediening van CRISPR-complex in jonge embryo’s tijdens hun syncytiele stadium. Hier bieden we een protocol van CRISPR-gemedieerde mutagenese in Harpegnathos saltator, een ponerinemierensoort die opvallende fenotypische plasticiteit vertoont. H. saltatormieren worden gemakkelijk gekweekt in een laboratoriumomgeving. Embryo’s worden verzameld voor micro-injectie met Cas9-eiwitten en in vitro gesynthetiseerde kleine gids RNA’s (sgRNA’s) met behulp van zelfgemaakte kwartsnaalden. Embryo’s na injectie worden buiten de kolonie grootgebracht. Na het ontstaan van de eerste larve worden alle embryo’s en larven met enkele verpleegsters naar een nestkast getransporteerd voor verdere ontwikkeling. Dit protocol is geschikt voor het induceren van mutagenese voor analyse van kastespecifieke fysiologie en sociaal gedrag bij mieren, maar kan ook worden toegepast op een breder spectrum van hymenopteranen en andere insecten.
Introduction
De evolutie van eusocialiteit bij insecten, namelijk die van de orden Hymenoptera en Blattodea (voorheen Isoptera), heeft geresulteerd in unieke en vaak geavanceerde gedragskenmerken die zich manifesteren op zowel individueel als kolonieniveau. Reproductieve arbeidsverdeling, een eigenschap die de meest geavanceerde groepen sociale insecten kenmerkt, omvat vaak kastensystemen die bestaan uit verschillende gedragsmatige en vaak morfologisch onderscheidende groepen. Een dergelijke gedrags- en morfologische diversiteit tussen kasten wordt niet alleen gecontroleerd door hun genetisch systeem, maar ook vaak door de omgeving 1,2,3,4, waardoor eusociale insecten aantrekkelijke onderwerpen zijn voor genetisch en epigenetisch onderzoek.
Het vermogen om het genetische systeem van eusociale insecten te manipuleren is een uitdaging gebleken, omdat veel soorten niet paren en zich voortplanten in laboratoriumomgevingen. De meeste eusociale insecten hebben ook zeer weinig reproductieve individuen in een kolonie, waardoor het aantal nakomelingen dat kan worden geproduceerd wordt beperkt en bijgevolg de steekproefgrootte voor genetische manipulatie wordt beperkt5. Bovendien hebben veel eusociale insecten lange generatietijden in vergelijking met insecten die vaak worden gebruikt voor genetische studies (zoals Drosophila), wat bijdraagt aan de moeilijkheid om genetische lijnen vast te stellen5. Sommige eusociale soorten kunnen echter een groot deel van de reproductief actieve individuen in een kolonie genereren, wat de uitdagingen verlicht en mogelijkheden biedt om mutante of transgene lijnen vast te stellen.
In het geval van de ponerinemierensoort, Harpegnathos saltator, kunnen alle vrouwelijke werksters reproductief actief worden na de dood van een koningin of sociaal isolement. Deze arbeiders worden “gamergates” genoemd en kunnen worden gebruikt om nieuwe kolonies te genereren6. Bovendien kan er meer dan één gamergate aanwezig zijn in een kolonie, waardoor de productie van nakomelingenmet 5,7,8 toeneemt. Tot nu toe zijn mutante en/of transgene lijnen ontwikkeld in de Europese honingbij, Apis mellifera, en in de mierensoort, H. saltator, Ooceraea biroi en Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Genetische analyses bij sociale bijen en mieren hebben de weg vrijgemaakt voor een beter begrip van eusocialiteit, waardoor een scala aan mogelijkheden wordt geboden om genen en hun effecten op eusociale insectengedrag en kastespecifieke fysiologie te bestuderen.
Hier bieden we een protocol voor genetische modificatie via het CRISPR/Cas9-systeem in H. saltator. Specifiek werd deze techniek gebruikt om een kiembaanmutatie te genereren in orco, het gen dat codeert voor de obligate co-receptor van alle odorantreceptoren (OK’s)10. OR-genen zijn opmerkelijk uitgebreid in hymenopteriaanse eusociale insecten16, en orco speelt een essentiële rol in de reuk van insecten; bij afwezigheid ervan monteren of functioneren OK’s niet normaal. Mutaties van het orco-gen verstoren daarom de reuksensatie, neurale ontwikkeling en geassocieerd sociaal gedrag 9,10.
In dit protocol worden Cas9-eiwitten en kleine gids-RNA’s (sgRNA’s) in mierenembryo’s geïntroduceerd met behulp van micro-injectie met als doel mutagenese van een doelgen te induceren. Hier zullen we de micro-injectieprocedure in detail beschrijven, samen met aanwijzingen met betrekking tot de verzorging van kolonies en geïnjecteerde embryo’s. Deze methoden zijn geschikt voor het induceren van mutagenese in een verscheidenheid aan verschillende genen in H. saltatormieren en kunnen worden toegepast op een breder spectrum van hymenopteraninsecten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De evolutie van eusocialiteit bij insecten, waaronder mieren, bijen, wespen en termieten, heeft geresulteerd in het verschijnen van nieuwe gedrags- en morfologische eigenschappen, waarvan er vele worden verondersteld te worden beïnvloed door een combinatie van omgevings- en genetische factoren 1,2,3,4. Helaas is de aantrekkelijkheid en bruikbaarheid van eusociale insecten als onderzoeksmodelle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de laboratoria van Danny Reinberg en Claude Desplan aan de New York University en het laboratorium van Jürgen Liebig aan de Arizona State University voor hun steun aan mierengenetica. Hua Yan erkent de steun van de National Science Foundation I/UCRC, het Center for Arthropod Management Technologies onder Grant No. IIP-1821914 en door partners uit de industrie. Maya Saar werd ondersteund door het United States – Israel Binational Agricultural Research and Development Fund, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
