זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס
Summary
מאפיינים רבים של אאוסוציאליות חרקים נשענים על תקשורת בתוך המושבה וחלוקת עבודה. מניפולציה גנטית של גנים רגולטוריים מרכזיים בעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה ומוטגנזה בתיווך קריספר מספקת תובנות על טבעה של התנהגות אלטרואיסטית בחרקים אאוסוציאליים.
Abstract
התכונות הייחודיות של חרקים אאוסוציאליים, כגון התנהגות חברתית וחלוקת עבודה רבייתית, נשלטות על ידי המערכת הגנטית שלהם. כדי לטפל באופן שבו גנים מווסתים תכונות חברתיות, פיתחנו נמלים מוטנטיות באמצעות העברה של קומפלקס קריספר לעוברים צעירים בשלב הסינסיטיאלי שלהם. כאן, אנו מספקים פרוטוקול של מוטגנזה בתיווך קריספר במלח Harpegnathos, מין נמלה פונרין המציג פלסטיות פנוטיפית מרשימה. H . נמלים מלח מגודלים בקלות בסביבה מעבדתית. העוברים נאספים למיקרו-הזרקות עם חלבוני Cas9 ומסונתזים במבחנה של רנ”א קטנים (sgRNAs) באמצעות מחטי קוורץ תוצרת בית. עוברים לאחר הזרקה מגודלים מחוץ למושבה. לאחר הופעת הזחלים הראשונים, כל העוברים והזחלים מועברים לתיבת קן עם כמה עובדים סיעודיים להמשך פיתוח. פרוטוקול זה מתאים לגרימת מוטגנזה לניתוח פיזיולוגיה ספציפית לקאסטות והתנהגות חברתית בנמלים, אך ניתן ליישם אותו גם על ספקטרום רחב יותר של קרום הבתולים וחרקים אחרים.
Introduction
האבולוציה של האאוסוציאליות בחרקים, כלומר אלה של המסדרים Hymenoptera ו Blattodea (לשעבר Isoptera), הביאה תכונות התנהגותיות ייחודיות ולעתים קרובות מתוחכמות המתבטאות הן ברמת הפרט והן ברמת המושבה. חלוקת העבודה של הרבייה, תכונה המאפיינת את הקבוצות המתקדמות ביותר של חרקים חברתיים, כוללת לעתים קרובות מערכות קאסטות המורכבות מכמה קבוצות התנהגותיות ולעתים קרובות מורפולוגיות מובחנות. מגוון התנהגותי ומורפולוגי כזה בין קאסטות נשלט לא רק על ידי המערכת הגנטית שלהם, אלא גם לעתים קרובות על ידי הסביבה 1,2,3,4, מה שהופך חרקים אאוסוציאליים לנושאים אטרקטיביים למחקר גנטי ואפיגנטי.
היכולת לתמרן את המערכת הגנטית של חרקים אאוסוציאליים הוכחה כמאתגרת מכיוון שמינים רבים אינם מזדווגים ומתרבים בסביבות מעבדה. לרוב החרקים האאו-סוציאליים יש גם מעט מאוד פרטים רבייה במושבה, מה שמגביל את מספר הצאצאים שניתן לייצר וכתוצאה מכך, מגביל את גודל המדגם למניפולציה גנטית5. בנוסף, לחרקים אאוסוציאליים רבים יש זמני דור ארוכים בהשוואה לחרקים המשמשים בדרך כלל למחקרים גנטיים (כגון דרוזופילה), מה שמוסיף לקושי לבסס קווים גנטיים5. עם זאת, מינים אאו-סוציאליים מסוימים יכולים ליצור חלק גדול של פרטים פעילים רבייה במושבה, מה שמקל על האתגרים ומספק הזדמנויות להקים קווים מוטנטיים או מהונדסים.
במקרה של מין נמלת הפונרין, Harpegnathos saltator, כל העובדות יכולות להיות פעילות רבייה עם מותה של מלכה או בידוד חברתי. עובדים אלה מכונים “גיימרגייטס” וניתן להשתמש בהם ליצירת מושבות חדשות6. יתר על כן, ייתכן שיש יותר מגיימרגייט אחד נוכח במושבה, ובכך להגדיל את ייצור הצאצאים 5,7,8. עד כה פותחו קווים מוטנטיים ו/או מהונדסים בדבורת הדבש האירופית, Apis mellifera, ובמיני הנמלים, H. saltator, Ooceraea biroi ו-Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . ניתוחים גנטיים בדבורים ובנמלים חברתיות סללו את הדרך להבנה טובה יותר של אאוסוציאליות, וסיפקו מגוון הזדמנויות לחקר גנים והשפעתם על התנהגות חרקים אאו-סוציאליים ופיזיולוגיה ספציפית לקאסטות.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול לשינוי גנטי באמצעות מערכת CRISPR/Cas9 ב– H. saltator. באופן ספציפי, טכניקה זו שימשה ליצירת מוטציה germline ב orco, הגן המקודד את הקולטן המשותף המחייב של כל קולטני ריח (ORs)10. גנים של OR הורחבו להפליא בחרקים אאוסוציאליים של Hymenopteran16, ואורקו ממלא תפקיד חיוני בריח חרקים; בהיעדרו, ORs אינם מורכבים או מתפקדים כרגיל. מוטציות בגן אורקו משבשות אפוא את תחושת חוש הריח, את ההתפתחות העצבית ואת ההתנהגויות החברתיות הנלוות 9,10.
בפרוטוקול זה, חלבוני Cas9 ורנ”א מנחים קטנים (sgRNAs) מוחדרים לעוברי נמלים באמצעות מיקרו-הזרקה לצורך גרימת מוטגנזה של גן מטרה. כאן נתאר בפירוט את הליך המיקרו-הזרקה יחד עם הוראות לגבי הטיפול במושבות ובעוברים מוזרקים. שיטות אלה מתאימות לגרימת מוטגנזה במגוון גנים שונים בנמלים מסוג H. saltator , וניתן ליישם אותן על ספקטרום רחב יותר של חרקים קרום הבתולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
האבולוציה של האאוסוציאליות בקרב חרקים, כולל נמלים, דבורים, צרעות וטרמיטים, הביאה להופעתן של תכונות התנהגותיות ומורפולוגיות חדשות, שרבות מהן מובנות כמושפעות משילוב של גורמים סביבתיים וגנטיים 1,2,3,4. למרבה הצער, האטרקטיבי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים למעבדות של דני ריינברג וקלוד דספלן באוניברסיטת ניו יורק ולמעבדה של יורגן ליביג באוניברסיטת אריזונה סטייט על תמיכתם בגנטיקה של נמלים. הואה יאן מכיר בתמיכה של הקרן הלאומית למדע I/UCRC, המרכז לטכנולוגיות ניהול פרוקי רגליים תחת מענק מס ‘IIP-1821914 ועל ידי שותפים בתעשייה. מאיה סער נתמכה על ידי הקרן הדו-לאומית למחקר ופיתוח חקלאי ע”ש ארה”ב – ישראל, מלגת Vaadia-BARD לפוסט-דוקטורט מס’ FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
