Summary

Iniezioni di embrioni per mutagenesi mediata da CRISPR nel saltatore di Ant Harpegnathos

Published: February 09, 2021
doi:

Summary

Molte caratteristiche dell’eusocialità degli insetti si basano sulla comunicazione all’interno della colonia e sulla divisione del lavoro. La manipolazione genetica dei geni regolatori chiave negli embrioni di formiche tramite microiniezione e mutagenesi mediata da CRISPR fornisce informazioni sulla natura del comportamento altruistico negli insetti eusociali.

Abstract

I tratti unici degli insetti eusociali, come il comportamento sociale e la divisione riproduttiva del lavoro, sono controllati dal loro sistema genetico. Per affrontare il modo in cui i geni regolano i tratti sociali, abbiamo sviluppato formiche mutanti attraverso la consegna del complesso CRISPR in giovani embrioni durante la loro fase sinciziale. Qui, forniamo un protocollo di mutagenesi mediata da CRISPR in Harpegnathos saltator, una specie di formica ponerine che mostra una sorprendente plasticità fenotipica. Le formiche H. saltator sono facilmente allevate in un ambiente di laboratorio. Gli embrioni vengono raccolti per microiniezione con proteine Cas9 e piccoli RNA guida sintetizzati in vitro (sgRNA) utilizzando aghi di quarzo fatti in casa. Gli embrioni post-iniezione vengono allevati al di fuori della colonia. Dopo l’emergere della prima larva, tutti gli embrioni e le larve vengono trasportati in una cassetta nido con alcuni operatori infermieristici per un ulteriore sviluppo. Questo protocollo è adatto per indurre la mutagenesi per l’analisi della fisiologia specifica della casta e del comportamento sociale nelle formiche, ma può anche essere applicato a uno spettro più ampio di imenotteri e altri insetti.

Introduction

L’evoluzione dell’eusocialità negli insetti, in particolare quelli degli ordini Hymenoptera e Blattodea (ex Isoptera), ha portato a tratti comportamentali unici e spesso sofisticati che si manifestano sia a livello individuale che a livello di colonia. La divisione riproduttiva del lavoro, un tratto che caratterizza i gruppi più avanzati di insetti sociali, coinvolge spesso sistemi di caste composti da diversi gruppi comportamentali e spesso morfologicamente distinti. Tale diversità comportamentale e morfologica tra le caste è controllata non solo dal loro sistema genetico, ma anche spesso dall’ambiente 1,2,3,4, rendendo gli insetti eusociali soggetti attraenti per la ricerca genetica ed epigenetica.

La capacità di manipolare il sistema genetico degli insetti eusociali si è dimostrata impegnativa poiché molte specie non si accoppiano e si riproducono in laboratorio. La maggior parte degli insetti eusociali ha anche pochissimi individui riproduttivi in una colonia, limitando il numero di prole che possono essere prodotti e, di conseguenza, limitando la dimensione del campione per la manipolazione genetica5. Inoltre, molti insetti eusociali hanno tempi di generazione lunghi rispetto agli insetti comunemente usati per gli studi genetici (come Drosophila), aggiungendo alla difficoltà di stabilire linee genetiche5. Alcune specie eusociali, tuttavia, possono generare una grande percentuale di individui riproduttivamente attivi in una colonia, il che allevia le sfide e offre opportunità per stabilire linee mutanti o transgeniche.

Nel caso della specie di formica ponerine, Harpegnathos saltator, tutte le operaie possono diventare riproduttive attive alla morte di una regina o all’isolamento sociale. Questi lavoratori sono indicati come “gamergates” e possono essere utilizzati per generare nuove colonie6. Inoltre, ci può essere più di un gamergate presente in una colonia, aumentando così la produzione di prole 5,7,8. Finora, linee mutanti e/o transgeniche sono state sviluppate nell’ape mellifera europea, Apis mellifera, e nelle specie di formiche, H. saltator, Ooceraea biroi e Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Le analisi genetiche nelle api e nelle formiche sociali hanno aperto la strada a una migliore comprensione dell’eusocialità, fornendo una serie di opportunità per studiare i geni e il loro impatto sul comportamento degli insetti eusociali e sulla fisiologia specifica della casta.

Qui, forniamo un protocollo per la modificazione genetica tramite il sistema CRISPR / Cas9 in H. saltator. In particolare, questa tecnica è stata utilizzata per generare una mutazione germinale in orco, il gene che codifica il co-recettore obbligato di tutti i recettori odoranti (OR)10. I geni OR sono stati notevolmente espansi negli insetti eusociali imenotteri16 e orco svolge un ruolo essenziale nell’olfatto degli insetti; in sua assenza, le sale operatorie non si assemblano o non funzionano normalmente. Le mutazioni del gene orco interrompono quindi la sensazione olfattiva, lo sviluppo neurale e i comportamenti sociali associati 9,10.

In questo protocollo, le proteine Cas9 e i piccoli RNA guida (sgRNA) vengono introdotti negli embrioni di formica utilizzando la microiniezione allo scopo di indurre la mutagenesi di un gene bersaglio. Qui, descriveremo la procedura di microiniezione in dettaglio insieme alle indicazioni riguardanti la cura delle colonie e degli embrioni iniettati. Questi metodi sono appropriati per indurre la mutagenesi in una varietà di geni diversi nelle formiche H. saltator e possono essere applicati a uno spettro più ampio di insetti imenotteri.

Protocol

1. Manutenzione regolare delle colonie di salatori di Harpegnathos Mantenere colonie selvatiche di H. saltator in scatole di plastica trasparente in una sala di allevamento delle formiche a 22-25 °C e un fotoperiodo di 12 ore di luce: 12 ore di buio (12L:12D) programma di illuminazione.Utilizzare piccole scatole (9,5 x 9,5 cm2) per allevare singoli lavoratori o piccole colonie. Utilizzare scatole medie (19 x 13,5 cm 2) o scatole grandi (27 x 19 cm2) pe…

Representative Results

Utilizzando il protocollo fornito qui, l’editing del genoma negli embrioni di Harpegnathos saltator è stato eseguito con successo. Questi risultati sono stati convalidati tramite reazione a catena della polimerasi e clonazione pGEM del DNA estratto da embrioni iniettati seguiti dal sequenziamento del DNA. L’efficienza della mutagenesi somatica utilizzando questo protocollo ha raggiunto circa il 40%. I maschi mutanti F1 sono stati accoppiati con femmine wild type per produrre fem…

Discussion

L’evoluzione dell’eusocialità tra gli insetti, tra cui formiche, api, vespe e termiti, ha portato alla comparsa di nuovi tratti comportamentali e morfologici, molti dei quali sono intesi come influenzati da una combinazione di fattori ambientali e genetici 1,2,3,4. Sfortunatamente, l’attrattiva e l’utilità degli insetti eusociali come modelli di ricerca nel campo della genetica sono state ost…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano i laboratori di Danny Reinberg e Claude Desplan alla New York University e il laboratorio di Jürgen Liebig all’Arizona State University per il loro supporto sulla genetica delle formiche. Hua Yan riconosce il sostegno della National Science Foundation I / UCRC, del Center for Arthropod Management Technologies sotto Grant No. IIP-1821914 e dei partner industriali. Maya Saar è stata sostenuta dal Fondo binazionale per la ricerca e lo sviluppo agricolo degli Stati Uniti – Israele, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.

Materials

Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher 15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration PNA Bio CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet Hypogloss Products B00254CNJA The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope  Nikon Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip BioQuip 4748
FemtoJet ll microinjector Eppendorf 920010504 This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
NCBI database National Center for Biotechnology Information Gene ID: 105183395 
P-2000 Micropipette Puller Sutter Instruments P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) Pioneer Plastics 079C 
Plastic boxes (27 X 19 cm2) Pioneer Plastics 195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) Pioneer Plastics 028C 
Quartz glass without filament Sutter Instruments Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm World Precision Instruments 500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 Winsor and Newton 5301030

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Cite This Article
Sieber, K., Saar, M., Opachaloemphan, C., Gallitto, M., Yang, H., Yan, H. Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator . J. Vis. Exp. (168), e61930, doi:10.3791/61930 (2021).

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