Инъекции эмбрионов при CRISPR-опосредованном мутагенезе в соляном аппарате муравьиного харпегнатоса
Summary
Многие характеристики эусоциальности насекомых зависят от коммуникации внутри колонии и разделения труда. Генетическое манипулирование ключевыми регуляторными генами у эмбрионов муравьев с помощью микроинъекции и CRISPR-опосредованного мутагенеза дает представление о природе альтруистического поведения у эусоциальных насекомых.
Abstract
Уникальные черты эусоциальных насекомых, такие как социальное поведение и репродуктивное разделение труда, контролируются их генетической системой. Чтобы решить, как гены регулируют социальные черты, мы разработали мутантных муравьев путем доставки комплекса CRISPR в молодые эмбрионы во время их синцитиальной стадии. Здесь мы приводим протокол CRISPR-опосредованного мутагенеза у Harpegnathos saltator, вида понериновых муравьев, который демонстрирует поразительную фенотипическую пластичность. H. муравьи-солиторы легко выращиваются в лабораторных условиях. Эмбрионы собирают для микроинъекции с белками Cas9 и in vitro синтезируют малые направляющие РНК (sgRNAs) с помощью самодельных кварцевых игл. Эмбрионы после инъекции выращиваются вне колонии. После появления первой личинки все эмбрионы и личинки транспортируются в гнездовой ящик с несколькими кормящими работниками для дальнейшего развития. Этот протокол подходит для индуцирования мутагенеза для анализа кастовой физиологии и социального поведения у муравьев, но также может быть применен к более широкому спектру перепончатокрылых и других насекомых.
Introduction
Эволюция эусоциальности у насекомых, а именно у отрядов перепончатокрылых и Blattodea (ранее Isoptera), привела к уникальным и часто сложным поведенческим чертам, которые проявляются как на индивидуальном, так и на колониальном уровнях. Репродуктивное разделение труда, черта, характеризующая наиболее развитые группы общественных насекомых, часто включает кастовые системы, состоящие из нескольких поведенчески и часто морфологически отличительных групп. Такое поведенческое и морфологическое разнообразие между кастами контролируется не только их генетической системой, но и часто окружающей средой 1,2,3,4, что делает эусоциальных насекомых привлекательными объектами для генетических и эпигенетических исследований.
Способность манипулировать генетической системой эусоциальных насекомых оказалась сложной задачей, поскольку многие виды не спариваются и не размножаются в лабораторных условиях. Большинство эусоциальных насекомых также имеют очень мало репродуктивных особей в колонии, что ограничивает количество потомства, которое может быть произведено, и, следовательно, ограничивает размер выборки для генетических манипуляций5. Кроме того, многие эусоциальные насекомые имеют длительное время генерации по сравнению с насекомыми, обычно используемыми для генетических исследований (такими как дрозофила), что затрудняет установление генетических линий5. Некоторые эусоциальные виды, однако, могут генерировать большую долю репродуктивно активных особей в колонии, что облегчает проблемы и предоставляет возможности для установления мутантных или трансгенных линий.
В случае вида муравьев-понеринов, Harpegnathos saltator, все работницы могут стать репродуктивно активными после смерти королевы или социальной изоляции. Эти рабочие называются «гамергатами» и могут быть использованы для создания новых колоний6. Кроме того, в колонии может присутствовать более одного геймергейта, что увеличивает производство потомствана 5,7,8. До сих пор мутантные и/или трансгенные линии были разработаны у европейской медоносной пчелы, Apis mellifera, и у видов муравьев, H. saltator, Ooceraea biroi и Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Генетический анализ у социальных пчел и муравьев проложил путь к лучшему пониманию эусоциальности, предоставляя множество возможностей для изучения генов и их влияния на эусоциальное поведение насекомых и кастовую физиологию.
Здесь мы предоставляем протокол генетической модификации через систему CRISPR/Cas9 в H. saltator. В частности, этот метод был использован для генерации мутации зародышевой линии в orco, гене, кодирующем облигатный корецептор всех рецепторов одоранта (ORs)10. Гены OR были замечательно расширены у перепончатокрылых эусоциальных насекомых16, и orco играет важную роль в обонянии насекомых; при его отсутствии операционные системы не собираются и не функционируют нормально. Таким образом, мутации гена orco нарушают обонятельные ощущения, нервное развитие и связанное с ними социальное поведение 9,10.
В этом протоколе белки Cas9 и малые направляющие РНК (sgRNAs) вводятся в эмбрионы муравьев с использованием микроинъекции с целью индуцирования мутагенеза гена-мишени. Здесь мы подробно опишем процедуру микроинъекции вместе с указаниями по уходу за колониями и введенными эмбрионами. Эти методы подходят для индуцирования мутагенеза в различных генах у муравьев H. saltator и могут быть применены к более широкому спектру перепончатокрылых насекомых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эволюция эусоциальности среди насекомых, включая муравьев, пчел, ос и термитов, привела к появлению новых поведенческих и морфологических признаков, многие из которых, как считается, находятся под влиянием комбинации экологических и генетических факторов 1,2,3,4.<sup class=…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят лаборатории Дэнни Рейнберга и Клода Деплана в Нью-Йоркском университете и лабораторию Юргена Либиха в Университете штата Аризона за их поддержку генетики муравьев. Хуа Янь признает поддержку со стороны Национального научного фонда I/UCRC, Центра технологий управления членистоногими в рамках гранта No IIP-1821914 и отраслевых партнеров. Майя Саар была поддержана Соединенными Штатами – Израильским двусторонним фондом сельскохозяйственных исследований и разработок, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Cas9 protein with NLS, high concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Cellophane Roll 20 inch X 5 feet | Hypogloss Products | B00254CNJA | The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests. |
| Eclipse Ci-S upright microscope | Nikon | Ci-S | |
| Featherweight forceps, narrow tip | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll microinjector | Eppendorf | 920010504 | This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead. |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 930001007 | |
| NCBI database | National Center for Biotechnology Information | Gene ID: 105183395 | |
| P-2000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C | |
| Plastic boxes (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C | |
| Quartz glass without filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Vannas scissors, 8.5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 | Winsor and Newton | 5301030 |
References
- Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
- Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
- Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
- Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
- Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
- Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
- Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
- Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
- Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
- Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
- Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
- Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
- Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
- Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
- Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
- Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
- Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
- Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
- Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
- Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).
