Summary

Инъекции эмбрионов при CRISPR-опосредованном мутагенезе в соляном аппарате муравьиного харпегнатоса

Published: February 09, 2021
doi:

Summary

Многие характеристики эусоциальности насекомых зависят от коммуникации внутри колонии и разделения труда. Генетическое манипулирование ключевыми регуляторными генами у эмбрионов муравьев с помощью микроинъекции и CRISPR-опосредованного мутагенеза дает представление о природе альтруистического поведения у эусоциальных насекомых.

Abstract

Уникальные черты эусоциальных насекомых, такие как социальное поведение и репродуктивное разделение труда, контролируются их генетической системой. Чтобы решить, как гены регулируют социальные черты, мы разработали мутантных муравьев путем доставки комплекса CRISPR в молодые эмбрионы во время их синцитиальной стадии. Здесь мы приводим протокол CRISPR-опосредованного мутагенеза у Harpegnathos saltator, вида понериновых муравьев, который демонстрирует поразительную фенотипическую пластичность. H. муравьи-солиторы легко выращиваются в лабораторных условиях. Эмбрионы собирают для микроинъекции с белками Cas9 и in vitro синтезируют малые направляющие РНК (sgRNAs) с помощью самодельных кварцевых игл. Эмбрионы после инъекции выращиваются вне колонии. После появления первой личинки все эмбрионы и личинки транспортируются в гнездовой ящик с несколькими кормящими работниками для дальнейшего развития. Этот протокол подходит для индуцирования мутагенеза для анализа кастовой физиологии и социального поведения у муравьев, но также может быть применен к более широкому спектру перепончатокрылых и других насекомых.

Introduction

Эволюция эусоциальности у насекомых, а именно у отрядов перепончатокрылых и Blattodea (ранее Isoptera), привела к уникальным и часто сложным поведенческим чертам, которые проявляются как на индивидуальном, так и на колониальном уровнях. Репродуктивное разделение труда, черта, характеризующая наиболее развитые группы общественных насекомых, часто включает кастовые системы, состоящие из нескольких поведенчески и часто морфологически отличительных групп. Такое поведенческое и морфологическое разнообразие между кастами контролируется не только их генетической системой, но и часто окружающей средой 1,2,3,4, что делает эусоциальных насекомых привлекательными объектами для генетических и эпигенетических исследований.

Способность манипулировать генетической системой эусоциальных насекомых оказалась сложной задачей, поскольку многие виды не спариваются и не размножаются в лабораторных условиях. Большинство эусоциальных насекомых также имеют очень мало репродуктивных особей в колонии, что ограничивает количество потомства, которое может быть произведено, и, следовательно, ограничивает размер выборки для генетических манипуляций5. Кроме того, многие эусоциальные насекомые имеют длительное время генерации по сравнению с насекомыми, обычно используемыми для генетических исследований (такими как дрозофила), что затрудняет установление генетических линий5. Некоторые эусоциальные виды, однако, могут генерировать большую долю репродуктивно активных особей в колонии, что облегчает проблемы и предоставляет возможности для установления мутантных или трансгенных линий.

В случае вида муравьев-понеринов, Harpegnathos saltator, все работницы могут стать репродуктивно активными после смерти королевы или социальной изоляции. Эти рабочие называются «гамергатами» и могут быть использованы для создания новых колоний6. Кроме того, в колонии может присутствовать более одного геймергейта, что увеличивает производство потомствана 5,7,8. До сих пор мутантные и/или трансгенные линии были разработаны у европейской медоносной пчелы, Apis mellifera, и у видов муравьев, H. saltator, Ooceraea biroi и Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Генетический анализ у социальных пчел и муравьев проложил путь к лучшему пониманию эусоциальности, предоставляя множество возможностей для изучения генов и их влияния на эусоциальное поведение насекомых и кастовую физиологию.

Здесь мы предоставляем протокол генетической модификации через систему CRISPR/Cas9 в H. saltator. В частности, этот метод был использован для генерации мутации зародышевой линии в orco, гене, кодирующем облигатный корецептор всех рецепторов одоранта (ORs)10. Гены OR были замечательно расширены у перепончатокрылых эусоциальных насекомых16, и orco играет важную роль в обонянии насекомых; при его отсутствии операционные системы не собираются и не функционируют нормально. Таким образом, мутации гена orco нарушают обонятельные ощущения, нервное развитие и связанное с ними социальное поведение 9,10.

В этом протоколе белки Cas9 и малые направляющие РНК (sgRNAs) вводятся в эмбрионы муравьев с использованием микроинъекции с целью индуцирования мутагенеза гена-мишени. Здесь мы подробно опишем процедуру микроинъекции вместе с указаниями по уходу за колониями и введенными эмбрионами. Эти методы подходят для индуцирования мутагенеза в различных генах у муравьев H. saltator и могут быть применены к более широкому спектру перепончатокрылых насекомых.

Protocol

1. Регулярное обслуживание колоний сальтаторов Harpegnathos Поддерживайте колонии H. saltator дикого типа в прозрачных пластиковых коробках в комнате для выращивания муравьев при 22-25 ° C и фотопериоде 12 часов света: 12 часов темного (12L: 12D) графика освещения.Используйте небольшие…

Representative Results

Используя протокол, представленный здесь, редактирование генома эмбрионов Harpegnathos saltator было успешно выполнено. Эти результаты были подтверждены с помощью полимеразной цепной реакции и pGEM-клонирования ДНК, извлеченной из введенных эмбрионов с последующим секвен?…

Discussion

Эволюция эусоциальности среди насекомых, включая муравьев, пчел, ос и термитов, привела к появлению новых поведенческих и морфологических признаков, многие из которых, как считается, находятся под влиянием комбинации экологических и генетических факторов 1,2,3,4.<sup class=…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят лаборатории Дэнни Рейнберга и Клода Деплана в Нью-Йоркском университете и лабораторию Юргена Либиха в Университете штата Аризона за их поддержку генетики муравьев. Хуа Янь признает поддержку со стороны Национального научного фонда I/UCRC, Центра технологий управления членистоногими в рамках гранта No IIP-1821914 и отраслевых партнеров. Майя Саар была поддержана Соединенными Штатами – Израильским двусторонним фондом сельскохозяйственных исследований и разработок, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.

Materials

Antibiotic-Antimycotic (100X) ThermoFisher 15240-062
Cas9 protein with NLS, high concentration PNA Bio CP02
Cellophane Roll 20 inch X 5 feet Hypogloss Products B00254CNJA The product has many color variations. Purchase it in red for use in making ant nests.
Eclipse Ci-S upright microscope  Nikon Ci-S
Featherweight forceps, narrow tip BioQuip 4748
FemtoJet ll microinjector Eppendorf 920010504 This product is no longer sold or supported by Eppendorf. A comparable microinjector may be used instead.
Microloader pipette tips Eppendorf 930001007
NCBI database National Center for Biotechnology Information Gene ID: 105183395 
P-2000 Micropipette Puller Sutter Instruments P-2000/G
Plastic boxes (19 X 13.5 cm2) Pioneer Plastics 079C 
Plastic boxes (27 X 19 cm2) Pioneer Plastics 195C
Plastic boxes (9.5 X 9.5 cm2) Pioneer Plastics 028C 
Quartz glass without filament Sutter Instruments Q100-50-7.5
Vannas scissors, 8.5 cm World Precision Instruments 500086
Winsor & Newton Cotman Water Colour Series 111 Short Handle Synthetic Brush – Round #000 Winsor and Newton 5301030

References

  1. Evans, J. D., Wheeler, D. E. Expression profiles during honeybee caste determination. Genome Biology. 2 (1), 1-6 (2000).
  2. Keller, L. Adaptation and the genetics of social behaviour. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 364 (1533), 3209-3216 (2009).
  3. Cahan, S. H., et al. Extreme genetic differences between queens and workers in hybridizing Pogonomyrmex harvester ants. Proceedings. Biological Sciences. 269 (1503), 1871-1877 (2002).
  4. Volny, V. P., Gordon, D. M. Genetic basis for queen-worker dimorphism in a social insect. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (9), 6108-6111 (2002).
  5. Yan, H., et al. Eusocial insects as emerging models for behavioural epigenetics. Nature Reviews Genetics. 15 (10), 677-688 (2014).
  6. Liebig, J., Hölldobler, B., Peeters, C. Are ant workers capable of colony foundation. Naturwissenschaften. 85 (3), 133-135 (1998).
  7. Bonasio, R. Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1260 (1), 14-23 (2012).
  8. Peeters, C., Liebig, J., Hölldobler, B. Sexual reproduction by both queens and workers in the ponerine ant Harpegnathos saltator. Insectes Sociaux. 47 (4), 325-332 (2000).
  9. Trible, W., et al. orco mutagenesis causes loss of antennal lobe glomeruli and impaired social behavior in ants. Cell. 170 (4), 727-735 (2017).
  10. Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
  11. Kohno, H., Suenami, S., Takeuchi, H., Sasaki, T., Kubo, T. Production of knockout mutants by CRISPR/Cas9 in the European honeybee, Apis mellifera L. Zoological Science. 33 (5), 505-512 (2016).
  12. Kohno, H., Kubo, T. mKast is dispensable for normal development and sexual maturation of the male European honeybee. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  13. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 9003-9008 (2014).
  14. Hu, X. F., Zhang, B., Liao, C. H., Zeng, Z. J. High-efficiency CRISPR/Cas9-mediated gene editing in honeybee (Apis mellifera) embryos. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (5), 1759-1766 (2019).
  15. Chiu, Y. K., Hsu, J. C., Chang, T., Huang, Y. C., Wang, J. Mutagenesis mediated by CRISPR/Cas9 in the red imported fire ant, Solenopsis invicta. Insectes Sociaux. 67 (2), 317-326 (2020).
  16. Zhou, X., et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLoS Genetics. 8 (8), 1002930 (2012).
  17. Sutter, P-2000 Laser Based Micropipette Puller System Operation Manual. 2.2 edn. Sutter Instrument Company. , (2012).
  18. Perry, M., et al. Expanded color vision in butterflies: molecular logic behind three way stochastic choices. Nature. 535 (7611), 280-284 (2016).
  19. Bonasio, R., et al. Genomic comparison of the ants Camponotus floridanus and Harpegnathos saltator. Science. 329 (5995), 1068-1071 (2010).
  20. Shields, E. J., Sheng, L., Weiner, A. K., Garcia, B. A., Bonasio, R. High-quality genome assemblies reveal long non-coding RNAs expressed in ant brains. Cell Reports. 23 (10), 3078-3090 (2018).
  21. Henderson, D. S. . Drosophila Cytogenetics Protocols. , (2004).
  22. Kern, R., Stobrawa, S. . Step-by-Step Guide: Microinjection of Adherent Cells with the Eppendorf Injectman® 4 and Femtojet® 4. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Sieber, K., Saar, M., Opachaloemphan, C., Gallitto, M., Yang, H., Yan, H. Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator . J. Vis. Exp. (168), e61930, doi:10.3791/61930 (2021).

View Video