Summary

Empreinte de protéines de radicaux hydroxyles sans laser pour effectuer une analyse structurelle d’ordre supérieur des protéines

Published: June 04, 2021
doi:

Summary

Ce protocole présente une méthode pour utiliser la dosimétrie radicale en ligne et une source de lumière plasma pour effectuer l’empreinte des protéines d’oxydation flash. Cette méthode remplace le laser UV dangereux pour simplifier et améliorer la reproductibilité de l’oxydation photochimique rapide des études de protéines.

Abstract

L’empreinte des protéines du radical hydroxyle (HRPF) est une technique d’analyse structurelle d’ordre supérieur émergente et prometteuse qui fournit des informations sur les changements dans la structure des protéines, les interactions protéine-protéine ou les interactions protéine-ligand. HRPF utilise des radicaux hydroxyles(▪OH) pour étiqueter de manière irréversible la surface accessible au solvant d’une protéine. La complexité inhérente, le coût et la nature dangereuse de l’exécution du FPRH ont considérablement limité l’adoption à grande échelle dans la biopharmaceutique. Ces facteurs comprennent : 1) l’utilisation de lasers compliqués, dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité importantes; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond de l’OH qui limitent les études comparatives. Cette publication fournit un protocole pour le fonctionnement d’un système HRPF sans laser. Ce système HRPF sans laser utilise une technologie d’oxydation flash de source de lumière plasma à haute énergie et à haute pression avec dosimétrie radicale en ligne. La source de lumière plasmatique est plus sûre, plus facile à utiliser et plus efficace pour générer des radicaux hydroxyles que les systèmes HRPF à base de laser, et le dosimètre radicalaire en ligne augmente la reproductibilité des études. Combiné, le système HRPF sans laser résout et surmonte les lacunes et les limites mentionnées des techniques laser.

Introduction

La conformation des protéines et la structure d’ordre supérieur (HOS) associée sont les principaux déterminants de la bonne fonction biologique et du comportement aberrant1. Il en va de même pour les produits biopharmaceutiques, dont la structure et l’activité fonctionnelle dépendent de divers aspects de leur production et de leur environnement. Les changements biopharmaceutiques dans hos ont été liés aux réactions défavorables de drogue (ADR) attribuées à la pharmacologie indésirable et à la réponse immunologique patient2,3. L’apparition des ADR a alerté l’industrie biopharmaceutique sur le rôle essentiel que joue le HOS protéique dans la sécurité et l’efficacité des produits biothérapeutiques, et ils ont établi le besoin d’analyses HOS nouvelles et améliorées4.

L’empreinte des protéines radicales hydroxyles (HRPF) est une technique prometteuse pour suivre l’évolution de la protéine HOS. Hrpf implique le marquage irréversible de l’extérieur d’une protéine avec OH suivi d’une analyse par spectrométrie de masse (MS) pour identifier la surface accessible au solvant de la protéine5,6,7. HRPF a été utilisé avec succès pour détecter des défauts dans la protéine HOS et sa fonction8,9,caractériser le HOS d’anticorps monoclonaux (mAb)10,11,12,13,déterminer la liaison Kd d’un ligand14,et bien plusencore 15,16,17,18,19. Une méthode courante pour générer l’OH ▪pour HRPF est l’oxydation photochimique rapide des protéines (FPOP), qui utilise des lasers UV rapides à haute énergie pour produire de l’▪OH à partir de la photolyse deH2O2. Pour la plupart, FPOP utilise des lasers excimer coûteux utilisant des gaz dangereux (KrF) qui exigent des garanties substantielles pour éviter les blessures respiratoires et oculaires20. Pour éviter les risques d’inhalation, d’autres ont utilisé des lasers grenat en aluminium à yttrium en néodyme quadruple de fréquence (Nd: YAG)21, qui éliminent l’utilisation de gaz toxiques mais sont toujours coûteux, nécessitent une expertise opérationnelle importante et exigent des contrôles de lumière parasite étendus pour protéger les utilisateurs contre les blessures oculaires.

Bien qu’il soit possible d’obtenir de nombreux renseignements à l’aide du HRPF, l’adoption à grande échelle dans le secteur biopharmaceutique n’a pas été respectée. Deux obstacles à l’adoption limitée du HRPF comprennent: 1) l’utilisation de lasers dangereux et coûteux qui exigent des précautions de sécurité substantielles20; et 2) l’irréprochabilité du HRPF causée par le nettoyage de fond des OH qui limitent les études comparatives22. Pour supplanter l’utilisation du laser, une unité de photolyse flash plasma à haute vitesse et à haute énergie a été développée pour effectuer en toute sécurité le FPOP d’une manière facile. Pour améliorer l’irréprochabilité des expériences HRPF, une dosimétrie radicale en temps réel est mise en œuvre.

La pratique du HRPF a été limitée par l’irréprochabilité attribuée au nettoyage de fond de OH22. Bien que les ▪OH soient d’excellentes sondes de la topographie des protéines, elles réagissent également avec de nombreux constituants présents dans les préparations, ce qui rend nécessaire de mesurer la concentration efficace de radical disponible pour oxyder une protéine cible. Les variations dans la préparation tampon, la concentration de peroxyde d’hydrogène, les propriétés de ligand, ou la photolyse peuvent avoir comme conséquence des différences d’oxydation entre le groupe témoin et le groupe expérimental qui créent l’ambiguïté dans des études différentielles hos. L’ajout de la dosimétrie radicale en temps réel permet l’ajustement de l’effet charge OH et augmente donc la confiance et la reproductibilité lors d’une expérience HRPF. L’utilisation de la dosimétrie radicale dans le FPOP a été décrite ailleurs23,24,25,et est discutée plus en détail dans une publication récente26. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un nouveau système de photolyse flash et dosimétrie en temps réel pour étiqueter l’apo-myoglobine équine (aMb), en comparant les niveaux d’oxydation peptidique dans une expérience FPOP à celle obtenue lors de l’utilisation d’un laser excimer.

Protocol

1. Installation du tube capillaire À l’aide d’une pierre clivante de silice, cliver 250 μm diamètre intérieur (ID) capillaire de silice à 27 pouces. Vérifiez les extrémités capillaires pour une coupe propre et droite. Créez deux fenêtres d’environ 15 mm de longueur en brûlant le revêtement en polyimide. À partir de l’«extrémité inférieure », la première fenêtre de photolyse est éloignée de 90 mm de l’«extrémité inférieure » et la deuxième fenêtre de dosimètre à 2…

Representative Results

La source de plasma à haute pression couplée à la dosimétrie en temps réel permet un meilleur contrôle de ▪rendement en OH pour observer plus précisément les changements dans la structure des protéines d’ordre supérieur. L’ajout d’adénine permet un dosimètre radicalaire efficace en temps réel. Lors de l’oxydation, l’adénine perd son absorbance UV à 265 nm(figure 2A). Le changement dans l’absorbance de l’adénine est directement lié à la concentrati…

Discussion

Il y a plusieurs étapes critiques pour assurer le bon étiquetage des protéines pendant toute expérience HRPF. Tout d’abord, un débit et un débit d’éclair à la source appropriés sont choisis pour s’assurer que chaque bolus de l’échantillon est irradié une fois. Cela garantit que la protéine est exposée à un seul bolus de OH nouvellement formé. Une fois qu’une protéine est oxydée, la structure protéique d’ordre supérieur peut être modifiée. Pour être sûr que la structure pro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux ont été financés par l’Institut national des sciences médicales générales (R43GM125420 et R44GM125420).

Materials

15 mL Conical Centrifuge Tubes Fisher Scientific 14-959-53A any brand is sufficient
50 µL SGE Gastight Syringes Fisher Scientific SG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) Thermo Scientific
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS120-500
Apomyoglobin Sigma-Aldrich
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Centrifuge Eppendorf 022625501
Delicate Task Wipers Fisher Scientific 06-666A
Hydrogen Peroxide Fisher Scientific H325-100 any 30% hydrogen peroxide is sufficient
Methionine amide Chem-Impex 03109
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002436
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used
Pierce Trypsin Protease, MS Grade Thermo Scientific 90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” Molex 1068680064 any capillary tubing cutter is sufficient
UPLC Thermo Scientific
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade Fisher Scientific LS118-500
Water, LC/MS Grade Fisher Scientific W6-4

References

  1. Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
  2. Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
  3. Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
  4. Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
  5. Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
  6. Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
  7. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
  8. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  9. Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
  10. Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
  11. Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
  12. Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  13. Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
  14. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  15. Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
  16. Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
  17. Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
  18. Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
  19. Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
  20. Linde. . Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
  21. Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
  22. Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
  23. Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
  24. Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
  25. Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
  26. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
  27. Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
  28. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
  29. Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
  30. Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
  31. Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
  32. Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
  33. Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
  34. Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
  35. Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
  36. Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
  37. Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).

Play Video

Cite This Article
Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free Hydroxyl Radical Protein Footprinting to Perform Higher Order Structural Analysis of Proteins. J. Vis. Exp. (172), e61861, doi:10.3791/61861 (2021).

View Video