Huella De Proteína De Radicales Hidroxilo Libre De Láser Para Realizar Análisis Estructurales De Orden Superior De Proteínas

La conformación de las proteínas y la estructura de orden superior (HOS) asociada son los principales determinantes de la función biológica adecuada y el comportamiento aberrante¹. Lo mismo se aplica a los productos biofarmacéuticos, cuya estructura y actividad funcional depende de diversos aspectos de su producción y entorno. El cambio biofarmacéutico en el SCA se ha relacionado con reacciones adversas a fármacos (ADR) atribuidas a la farmacología indeseable y a la respuesta inmunológica del paciente^2,3. La aparición de los ADR ha alertado a la industria biofarmacéutica sobre el papel crítico que juega la proteína HOS en la seguridad y eficacia de la bioterapéutica, y han establecido la necesidad de nuevos y mejorados análisis de HOS^4.

La huella de proteína radical hidroxilo (HRPF) es una técnica prometedora para rastrear el cambio en la proteína HOS. Hrpf implica el etiquetado irreversible del exterior de una proteína con ^▪OH seguido de espectrometría de masas (MS) análisis para identificar la superficie accesible solvente de la proteína^5,6,7. Hrpf se ha utilizado con éxito para detectar defectos en la proteína HOS y su función^8,9,caracterizar el HOS de anticuerpos monoclonales (mAb)^10,11,12,13,determinar la unión Kd de un ligando^14,y mucho más^{15,16,17,18,19.} Un método común para generar el ^▪OH para HRPF es la oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP), que emplea láseres UV rápidos y de alta energía para producir ^▪OH a partir de la fotólisis de_H2O_2. En su mayor parte, FPOP utiliza costosos láseres excímeros que emplean gas peligroso (KrF) que exige protecciones sustanciales para evitar lesiones respiratorias y oculares²⁰. Para evitar los peligros de inhalación, otros han utilizado láseres de granate de aluminio de neodimio cuadruplicado^defrecuencia (Nd: YAG), que elimina el uso de gases tóxicos pero siguen siendo costosos, requieren una experiencia operativa significativa y exigen amplios controles de luz extraviada para proteger a los usuarios de lesiones oculares.

Aunque se puede obtener amplia información utilizando HRPF, no se ha cumplido una amplia adopción en la biofarmacéutica. Dos barreras para la adopción limitada de HRPF incluyen: 1) el uso de láseres peligrosos y costosos que exigen precauciones de seguridad sustanciales^20; y 2) la irreproducibilidad de la FCR causada por el barrido de fondo de ^▪OH que limitan los estudios comparativos^22. Para suplantar el uso del láser, se desarrolló una unidad de fotólisis de flash de plasma de alta velocidad y alta energía para realizar FPOP de forma segura de una manera fácil. Para mejorar la irreproducibilidad de los experimentos de HRPF, se implementa la dosimetría radical en tiempo real.

La práctica de HRPF ha sido limitada por la irreproducibilidad atribuida al barrido del fondo de ^▪OH^22. Mientras ^{que ▪}OH son sondas excelentes de la topografía de la proteína, también reaccionan con muchos componentes encontrados en preparaciones, haciéndole necesario medir la concentración eficaz de radical disponible para oxidar una proteína de la blanco. Las variaciones en la preparación del tampón, la concentración de peróxido de hidrógeno, las propiedades del ligando o la fotólisis pueden resultar en diferencias de oxidación entre los grupos de control y experimentales que crean ambigüedad en los estudios diferenciales de HOS. La adición de dosimetría radical en tiempo real permite el ajuste del efecto ^▪carga de OH y, por lo tanto, aumenta la confianza y la reproducibilidad durante un experimento de HRPF. El uso de la dosimetría radical en FPOP se ha descrito en otra parte^23,24,25,y se discute más detalladamente en una publicación reciente^26. Aquí, se describe el uso de un nuevo sistema de fotólisis flash y dosimetría en tiempo real para etiquetar la apo-mioglobina equina (aMb), comparando los niveles de oxidación de péptidos en un experimento FPOP a la de obtenido cuando se utiliza un láser excímero.