ليزر خالية من هيدروكسيل البروتين الراديكالي البصمة لأداء أعلى ترتيب التحليل الهيكلي للبروتينات
Summary
يقدم هذا البروتوكول طريقة لاستخدام قياس الجرعات الراديكالي المضمن ومصدر ضوء البلازما لأداء بصمة بروتين أكسدة الفلاش. هذه الطريقة تحل محل ليزر الأشعة فوق البنفسجية الخطرة لتبسيط وتحسين استنساخ الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة لدراسات البروتين.
Abstract
Hydroxyl الراديكالية البروتين البصمة (HRPF) هو الناشئة والواعدة أعلى ترتيب تقنية التحليل الهيكلي الذي يوفر معلومات عن التغيرات في بنية البروتين، والتفاعلات البروتين البروتين، أو التفاعلات البروتين ليغاند. HRPF يستخدم الجذور الهيدروكسيل(▪OH) لتسمية لا رجعة فيه سطح المذيبات البروتين يمكن الوصول إليها. وقد حد التعقيد المتأصل في أداء الشراكة البشرية المحمية وتكلفته وطبيعته الخطرة إلى حد كبير من الاعتماد الواسع النطاق في مجال الصيدلة الحيوية. وتشمل هذه العوامل: 1) استخدام الليزر المعقد والخطير والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة؛ (2) استخدام أجهزة الليزر المعقدة والخطرة والمكلفة التي تتطلب احتياطات أمان كبيرة؛ (2) استخدام أجهزة الليزر المعقدة والكواية التي تتطلب احتياطات كبيرة للسلامة؛ (2) استخدام أجهزة الليزر المعقدة والكواية و 2) عدم قابلية الحماية من HRPF الناجمة عن مسح الخلفية من ▪OH التي تحد من الدراسات المقارنة. يوفر هذا المنشور بروتوكولا لتشغيل نظام HRPF خال من الليزر. يستخدم نظام HRPF الخالي من الليزر تقنية أكسدة فلاش مصدر ضوء البلازما عالية الطاقة والضغط العالي مع قياس الجرعات الراديكالي في الخط. مصدر ضوء البلازما هو أكثر أمانا، وأسهل في الاستخدام، وأكثر كفاءة في توليد الجذور الهيدروكسيل من أنظمة HRPF القائمة على الليزر، ومقياس الجرعات الراديكالية في الخط يزيد من استنساخ الدراسات. وإلى جانب ذلك، يعالج نظام HRPF الخالي من الليزر النقائص والقيود المذكورة في التقنيات القائمة على الليزر ويتغلب عليها.
Introduction
تشكيل البروتين وما يرتبط به من بنية النظام الأعلى (HOS) هي المحددات الرئيسية للوظيفة البيولوجية السليمة والسلوك الشاذ1. وينطبق الشيء نفسه على المستحضرات الصيدلانية الحيوية، التي يعتمد هيكلها ونشاطها الوظيفي على جوانب مختلفة من إنتاجها وبيئتها. وقد تم ربط التغير الصيدلاني الحيوي في HOS إلى ردود الفعل الدوائية السلبية (ADR) المنسوبة إلى الصيدلة غير المرغوب فيها والاستجابة المناعية للمريض2،3. وقد نبه ظهور ADRs صناعة الأدوية الحيوية إلى الدور الحاسم الذي يلعبه البروتين HOS في سلامة وفعالية العلاج الحيوي ، وأنها أثبتت الحاجة إلى تحليلات HOS جديدة ومحسنة4.
هيدروكسيل البروتين الراديكالي البصمة (HRPF) هو تقنية واعدة لتتبع التغيير في البروتين HOS. HRPF ينطوي على وضع علامات لا رجعة فيها من السطح الخارجي للبروتين مع ▪OH تليها تحليل الطيف الكتلي (MS) لتحديد سطح المذيبات التي يمكن الوصول إليها من البروتين5،6،7. HRPF وقد استخدمت بنجاح للكشف عن عيوب في البروتين HOS ووظيفته8،9، تميز هوس من الأجسام المضادة أحادية النسيلة (ماب)10،11،12،13، تحديد KD ملزمة من14ليغاند ، وأكثر من ذلك بكثير15،16،17،18،19. وهناك طريقة شائعة لتوليد ▪OH لHRPF هو الأكسدة الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) ، والذي يستخدم عالية الطاقة ، وأشعة الليزر فوق البنفسجية السريعة لإنتاج ▪OH من التحليل الضوئي من H2O2. بالنسبة للجزء الأكبر، FPOP يستخدم الليزر إكسيمر مكلفة تستخدم الغاز الخطرة (KrF) التي تتطلب ضمانات كبيرة لتجنب إصابات الجهاز التنفسي والعين20. لتجنب مخاطر الاستنشاق، استخدم آخرون تردد أربع مرات النيودميوم yttrium العقيق الألومنيوم (Nd:YAG) الليزر21،الذي يلغي استخدام الغاز السام ولكن لا تزال مكلفة، وتتطلب خبرة عملية كبيرة، والمطالبة بضوابط واسعة النطاق ضوء ضالة لحماية المستخدمين من إصابات العين.
على الرغم من أنه يمكن الحصول على معلومات وافرة باستخدام HRPF ، لم يتم الوفاء بالتبني الواسع النطاق في biopharma. 21- ومن بين العوائق التي تحول دون اعتماد قوة حماية حقوق الإنسان المحدودة: 1) استخدام الليزر الخطر والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة 20؛ (2) استخدام أجهزة الليزر الخطرة والمكلفة التي تتطلب احتياطات كبيرة للسلامة 20؛ (2) استخدام الليزر الخطر والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة20؛ (2)استخدام الليزر الخطر والمكلف الذي يتطلب احتياطات أمان كبيرة و 2) عدم قابلية الحماية من HRPF الناجمة عن مسح الخلفية من ▪OH التي تحد من الدراسات المقارنة22. لتحل محل استخدام الليزر، تم تطوير وحدة تحلل ضوئي عالية السرعة وعالية الطاقة بالبلازما لأداء FPOP بأمان بطريقة سهلة. لتحسين عدم قابلية عدم الحماية لتجارب HRPF ، يتم تنفيذ قياس الجرعات الراديكالية في الوقت الحقيقي.
وقد تم الحد من ممارسة HRPF من عدم القابلية لدحض يعزى إلى مسح الخلفية من ▪OH22. في حين أن ▪OH هي مسابير ممتازة من تضاريس البروتين ، إلا أنها تتفاعل أيضا مع العديد من المكونات الموجودة في الاستعدادات ، مما يجعل من الضروري قياس التركيز الفعال للراديكالية المتاحة لأكسدة البروتين المستهدف. يمكن أن تؤدي الاختلافات في إعداد العازلة ، وتركيز بيروكسيد الهيدروجين ، وخصائص الليغند ، أو التحلل الضوئي إلى اختلافات الأكسدة بين مجموعات التحكم والتجريبية التي تخلق غموضا في الدراسات التفاضلية HOS. إضافة قياس الجرعات الراديكالية في الوقت الحقيقي تمكن من تعديل تأثير ▪تحميل OH وبالتالي يزيد من الثقة والتكرار خلال تجربة HRPF. وقد وصف استخدام قياس الجرعات الراديكالية في FPOP في مكان آخر23،24،25، ويناقش بمزيد من التفصيل في منشور صدر مؤخرا26. هنا، ونحن نصف استخدام نظام التحلل الضوئي فلاش رواية وقياس الجرعات في الوقت الحقيقي لتسمية الخيول آبو-الميوجلوبين (AMb)، مقارنة مستويات أكسدة الببتيد في تجربة FPOP لتلك التي تم الحصول عليها عند استخدام ليزر إكسيمر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من الخطوات الحاسمة لضمان وضع العلامات المناسبة للبروتينات خلال أي تجربة HRPF. أولا، يتم تحديد معدل تدفق مناسب ومعدل فلاش المصدر للتأكد من أن كل بولوس من العينة مشع مرة واحدة. وهذا يضمن أن يتعرض البروتين لبول واحد من oh ▪OH التي تشكلت حديثا. بمجرد أكسدة البروتين ، يمكن تغيير ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (R43GM125420 وR44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
- Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
- Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
- Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
- Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
- Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
- Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
- Linde. . Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
- Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
- Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
- Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
- Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
- Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
- Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
- Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
- Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
- Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
- Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).
