Лазерный гидроксилрадикал белковый след для выполнения структурного анализа белков более высокого порядка
Summary
Этот протокол представляет собой метод использования встроенной радикальной дозиметрии и плазменного источника света для выполнения флеш-окисления белка. Этот метод заменяет опасный УФ-лазер для упрощения и улучшения воспроизводимости быстрого фотохимического окисления белковых исследований.
Abstract
Гидроксилрадикалящий белковый след (HRPF) является новым и перспективным методом структурного анализа более высокого порядка, который предоставляет информацию об изменениях в структуре белка, белково-белковых взаимодействиях или белково-лигандных взаимодействиях. HRPF использует гидроксильные радикалы(▪ОН) для необратимой маркировки поверхности белка, доступной для растворителя. Сложность, стоимость и опасный характер выполнения HRPF существенно ограничили широкое внедрение в биофармацевтических системах. К таким факторам относятся: 1) использование сложных, опасных и дорогостоящих лазеров, требующих существенных мер предосторожности; и 2) невоспроизводимость HRPF, вызванная фоновой засоряющей ▪ОН, которые ограничивают сравнительные исследования. Данная публикация содержит протокол работы системы HRPF без лазера. Эта безлазерная система HRPF использует высокоэнергетическую технологию окисления плазменного источника света высокого давления с поточной радикальной дозиметрией. Плазменный источник света безопаснее, проще в использовании и более эффективен в генерации гидроксильных радикалов, чем лазерные системы HRPF, а поточный радикальный дозиметр повышает воспроизводимость исследований. В совокупности система HRPF без лазера устраняет и преодолевает упомянутые недостатки и ограничения лазерных методов.
Introduction
Конформация белка и связанная с ней структура высшего порядка (HOS) являются основными детерминантами правильной биологической функции и аберрантного поведения1. То же самое относится и к биофармацевтическим препаратам, структура и функциональная активность которых зависит от различных аспектов их производства и среды. Биофармацевтические изменения в ХОС были связаны с побочными лекарственными реакциями (ADR), приписываемыми нежелательной фармакологии и иммунологическому ответу пациента2,3. Появление АДР предупредило биофармацевтическую промышленность о критической роли, которую белок HOS играет в безопасности и эффективности биотерапевтических средств, и они установили необходимость в новой и улучшенной аналитике HOS4.
Гидроксилрадикалирование белка (HRPF) является перспективным методом отслеживания изменения белка HOS. HRPF включает необратимую маркировку внешней стороны белка с ▪OH с последующим масс-спектрометрическим (MS) анализом для идентификации доступной растворителю поверхности белка5,6,7. HRPF успешно применяется для выявления дефектов белка HOS и его функции8,9,характеризуют HOS моноклональных антител (mAb)10,11,12,13,определяют связывание Kd с лигандом14и более15,16,17,18,19. Распространенным методом генерации ▪OH для HRPF является быстрое фотохимическое окисление белков (FPOP), в котором используются высокоэнергетические, быстрые УФ-лазеры для получения ▪OH из фотолиза H2O2. По большей части, FPOP использует дорогие эксимерные лазеры, использующие опасный газ (KrF), который требует существенных гарантий, чтобы избежать травм дыхания и глаз20. Чтобы избежать опасности вдыхания, другие использовали частотные четырехкратные лазеры21из неодима иттрия алюминиевого граната (Nd: YAG), которые исключают использование токсичного газа, но по-прежнему являются дорогостоящими, требуют значительных эксплуатационных знаний и требуют обширных элементов управления рассеянным светом для защиты пользователей от травм глаз.
Хотя с помощью HRPF можно получить обширную информацию, широкое распространение в биофармацевтической отрасли не было достигнуто. Два барьера для ограниченного принятия HRPF включают: 1) использование опасных и дорогих лазеров, которые требуют существенных мер предосторожности20; и 2) невоспроизводимость HRPF, вызванная фоновой засорением ▪ОН, которые ограничивают сравнительные исследования22. Чтобы вытеснить использование лазера, была разработана высокоскоростная высокоэнергетическая установка фотолиза плазменной вспышки для безопасного выполнения FPOP в легкой манере. Для повышения невоспроизводимости экспериментов HRPF внедрена радикальная дозиметрия в реальном времени.
Практика ППЧ была ограничена невоспроизводимостью, приписываемой фоновому мусору ▪OH22. Хотя ▪ОН являются отличными зондами топографии белка, они также реагируют со многими компонентами, обнаруженными в препаратах, что делает необходимым измерение эффективной концентрации радикала, доступного для окисления целевого белка. Изменения в буферном препарате, концентрации перекиси водорода, свойствах лигандов или фотолизе могут привести к различиям в окислении между контрольной и экспериментальной группами, которые создают неопределенность в дифференциальных исследованиях HOS. Добавление радикальной дозиметрии в реальном времени позволяет регулировать эффект ▪нагрузки ОН и, следовательно, повышает уверенность и воспроизводимость во время эксперимента HRPF. Использование радикальной дозиметрии в FPOP было описано в другом месте23,24,25и подробно обсуждается в недавней публикации26. Здесь мы описываем использование новой системы фотолиза со вспышкой и дозиметрии в реальном времени для маркировки апомиоглобина лошадей (aMb), сравнивая уровни окисления пептидов в эксперименте FPOP с уровнями, полученными при использовании эксимерного лазера.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует несколько критических шагов для обеспечения правильной маркировки белков во время любого эксперимента HRPF. Во-первых, выбирается соответствующая скорость потока и скорость вспышки источника, чтобы убедиться, что каждый болюс образца облучается один раз. Это гарантирует, чт?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным институтом общих медицинских наук (R43GM125420 и R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
References
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K. Safety assessment of biosimilars in Europe: a regulatory perspective. Generics and Biosimilars Initiative Journal. , 1-8 (2014).
- Giezen, T. J., Mantel-Teeuwisse, A. K., Strauss, S. Safety-related regulatory actions for biologicals approved in the United States and the Europena Union. Journal of the American Medical Society. 300 (16), 1887-1896 (2008).
- Gabrielson, J. P., Weiss, W. F. Technical decision-making with higher order structure data: starting a new dialogue. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 1240-1245 (2015).
- Brenowitz, M., Erie, D. A., Chance, M. R. Catching RNA polymerase in the act of binding: intermediates in transcription illuminated by synchrotron footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (13), 4659-4660 (2005).
- Guan, J. Q., Takamoto, K., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. Structure and dynamics of the actin filament. Biochemistry. 44 (9), 3166-3175 (2005).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photochemical oxidataion to locate heme binding and conformataional changes in myoglobin. International Journal of Mass Spectrometry. 259 (2007), 124-129 (2007).
- Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Fast Photochemical Oxidation of Proteins (FPOP) for Higher Order Structure Characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
- Watson, C., Sharp, J. S. Conformational Analysis of Therapeutic Proteins by Hydroxyl Radical Protein Footprinting. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 14 (2), 206-217 (2012).
- Deperalta, G., et al. Structural analysis of a therapeutic monoclonal antibody dimer by hydroxyl radical footprinting. mAbs. 5 (1), 86-101 (2013).
- Jones, L. M., et al. Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).
- Storek, K. M., et al. Monoclonal antibody targeting the β-barrel assembly machine of Escherichia coli is bactericidal. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
- Vij, R., et al. A targeted boost-and-sort immunization strategy using Escherichia coli BamA identifies rare growth inhibitory antibodies. Scientific Reports. 8 (1), 7136 (2018).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Lu, Y., et al. Fast Photochemical Oxidation of Proteins Maps the Topology of Intrinsic Membrane Proteins: Light-Harvesting Complex 2 in a Nanodisc. Analytical Chemistry. 88 (17), 8827-8834 (2016).
- Marty, M., Zhang, H., Cui, W., Gross, M., Sligar, S. Interpretation and Deconvolution of Nanodisc Native Mass Spectra. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 25, (2013).
- Johnson, D. T., Di Stefano, L. H., Jones, L. M. Fast photochemical oxidation of proteins(FPOP): A powerful mass spectrometry based structural proteomics tool. Journal of Biological Chemistry. , (2019).
- Chea, E. E., Jones, L. M. Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting. Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).
- Aprahamian, M. L., Chea, E. E., Jones, L. M., Lindert, S. Rosetta Protein Structure Prediction from Hydroxyl Radical Protein Footprinting Mass Spectrometry Data. Analytical chemistry. 90 (12), 7721-7729 (2018).
- Linde. . Linde Specialty Gases of North America. , (2009).
- Aye, T. T., Low, T. Y., Sze, S. K. Nanosecond laser-induced photochemical oxidation method for protein surface mapping with mass spectrometry. Analytical Chemistry. 77 (18), 5814-5822 (2005).
- Niu, B., Zhang, H., Giblin, D., Rempel, D. L., Gross, M. L. Dosimetry determines the initial OH radical concentration in fast photochemical oxidation of proteins (FPOP). Journal of American Society of Mass Spectrometry. 26 (5), 843-846 (2015).
- Misra, S. K., Orlando, R., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Compensated Hydroxyl Radical Protein Footprinting Measures Buffer and Excipient Effects on Conformation and Aggregation in an Adalimumab Biosimilar. American Association of Pharmaceutical Scientists Journal. 21 (5), 87 (2019).
- Olson, L. J., Misra, S. K., Ishihara, M., Battaile, K. P., Grant, O. C., Sood, A., Woods, R. J., Kim, J. P., Tiemeyer, M., Ren, G., Sharp, J. S., Dahms, N. M. Allosteric regulation of lysosomal enzyme recognition by the cation-independent mannose 6-phosphate receptor. Communications Biology. 3 (1), 498 (2020).
- Sharp, J. S., Misra, S. K., Persoff, J. J., Egan, R. W., Weinberger, S. R. Real Time Normalization of Fast Photochemical Oxidation of Proteins Experiments by Inline Adenine Radical Dosimetry. Analytical Chemistry. 90 (21), 12625-12630 (2018).
- Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes. Journal of Visualized Experiments. 163, (2020).
- Hambly, D. M., Gross, M. L. Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass Spectrometry-Based Protein Footprinting for Higher-Order Structure Analysis: Fundamentals and Applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355 (2020).
- Jones, L. M., Sperry, B. J., Carroll, A. J., Gross, M. L. Fast photochemical oxidation of proteins for epitope mapping. Analytical chemistry. 83 (20), 7657-7661 (2011).
- Li, J., et al. Mapping the Energetic Epitope of an Antibody/Interleukin-23 Interaction with Hydrogen/Deuterium Exchange, Fast Photochemical Oxidation of Proteins Mass Spectrometry, and Alanine Shave Mutagenesis. Analytical chemistry. 89 (4), 2250-2258 (2017).
- Liu, X. R., Zhang, M. M., Rempel, D. L., Gross, M. L. A Single Approach Reveals the Composite Conformational Changes, Order of Binding, and Affinities for Calcium Binding to Calmodulin. Analytical Chemistry. 91 (9), 5508-5512 (2019).
- Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting. Molecular and Cellular Proteomics. 2 (10), 1120-1132 (2003).
- Chea, E. E., Deredge, D. J., Jones, L. M. Insights on the Conformational Ensemble of Cyt C Reveal a Compact State during Peroxidase Activity. Biophysical Journal. 118 (1), 128-137 (2020).
- Poor, T. A., et al. Probing the paramyxovirus fusion (F) protein-refolding event from pre- to postfusion by oxidative footprinting. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (25), 2596-2605 (2014).
- Roush, A. E., Riaz, M., Misra, S. K., Weinberger, S. R., Sharp, J. S. Intrinsic Buffer Hydroxyl Radical Dosimetry Using Tris(hydroxymethyl)aminomethane. Journal of American Society of Mass Spectrometry. 31 (2), 169-172 (2020).
- Everett, E. A., Falick, A. M., Reich, N. O. Identification of a critical cysteine in EcoRI DNA methyltransferase by mass spectrometry. Journal of Biological Chemistry. 265 (29), 17713-17719 (1990).
- Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Identification of specific carboxyl groups on uracil-DNA glycosylase inhibitor protein that are required for activity. Journal of Biological Chemistry. 271 (46), 29170-29181 (1996).
