Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine
Summary
Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l’impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell’ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.
Abstract
L’impronta proteica radicale idrossile (HRPF) è una tecnica di analisi strutturale emergente e promettente di ordine superiore che fornisce informazioni sui cambiamenti nella struttura proteica, sulle interazioni proteina-proteina o sulle interazioni proteina-ligando. HRPF utilizza radicali idrossilici(▪OH) per etichettare irreversibilmente la superficie accessibile al solvente di una proteina. La complessità intrinseca, i costi e la natura pericolosa delle prestazioni hrpf hanno sostanzialmente limitato l’adozione su larga scala in biofarmacia. Questi fattori includono: 1) l’uso di laser complicati, pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezza sostanziali; e 2) l’irriducibilità dell’HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studi comparativi. Questa pubblicazione fornisce un protocollo per il funzionamento di un sistema HRPF senza laser. Questo sistema HRPF senza laser utilizza una tecnologia di ossidazione flash sorgente di luce al plasma ad alta energia e alta pressione con dosimetria radicale in linea. La sorgente luminosa al plasma è più sicura, più facile da usare e più efficiente nella generazione di radicali idrossili rispetto ai sistemi HRPF basati su laser, e il dosimetro radicale in linea aumenta la riproducibilità degli studi. Combinato, il sistema HRPF senza laser risolve e supera le carenze e i limiti menzionati delle tecniche basate su laser.
Introduction
La conformazione proteica e la struttura di ordine superiore associata (HOS) sono i principali determinanti della corretta funzione biologica e del comportamento aberrante1. Lo stesso vale per i biofarmaci, la cui struttura e attività funzionale dipendono da vari aspetti della loro produzione e del loro ambiente. Il cambiamento biofarmaceutico nell’HOS è stato collegato a reazioni avverse ai farmaci (ADR) attribuite alla farmacologia indesiderabile e alla risposta immunologicadel paziente 2,3. La comparsa di ADR ha allertato l’industria biofarmaceutica sul ruolo critico che la proteina HOS svolge nella sicurezza e nell’efficacia della bioterapia e hanno stabilito la necessità di nuove e migliorate analisi HOS4.
L’ingombro di proteine radicali idrossili (HRPF) è una tecnica promettente per tenere traccia del cambiamento nella proteina HOS. HRPF comporta l’etichettatura irreversibile dell’esterno di una proteina con ▪OH seguita da analisi di spettrometria di massa (MS) per identificare la superficie accessibile al solventedella proteina 5,6,7. HRPF è stato utilizzato con successo per rilevare difetti nella proteina HOS e la suafunzione 8,9, caratterizzano l’HOS degli anticorpi monoclonali (mAb)10,11,12,13,determinare il Kd legante di un ligando14,e molto altro15,16,17,18,19. Un metodo comune per generare il ▪OH per HRPF è l’ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP), che impiega laser UV veloci ad alta energia per produrre ▪ OH dallafotolisi di H2O2. Per la maggior parte, FPOP utilizza costosi laser ad eccimeri che impiegano gas pericoloso (KrF) che richiede garanzie sostanziali per evitare lesioni respiratorie eoculari 20. Per evitare rischi di inalazione, altri hanno utilizzato laser in alluminio al neodimio yttrium alluminio quadruplicati a frequenza (Nd:YAG)21, che eliminano l’uso di gas tossici ma sono ancora costosi, richiedono una significativa competenza operativa e richiedono ampi controlli della luce vagante per proteggere gli utenti dalle lesioni agli occhi.
Sebbene sia possibile ottenere ampie informazioni utilizzando HRPF, non è stata soddisfatta un’ampia adozione in biofarmacia. Due ostacoli per la limitata adozione dell’HRPF comprendono: 1) l’uso di laser pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezzasostanziali 20; e 2) l’irriducibilità dell’HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studicomparativi 22. Per soppiantare l’uso del laser, è stata sviluppata un’unità di fotolisi flash al plasma ad alta velocità e ad alta energia per eseguire in modo sicuro FPOP in modo semplice. Per migliorare l’irriducibilità degli esperimenti HRPF, viene implementata la dosimetria radicale in tempo reale.
La pratica dell’HRPF è stata limitata dall’irriducibilità attribuita allo scavenging di fondo ▪OH22. Mentre ▪OH sono eccellenti sonde di topografia proteica, reagiscono anche con molti costituenti trovati nei preparati, rendendo necessario misurare l’effettiva concentrazione di radicale disponibile per ossidare una proteina bersaglio. Variazioni nella preparazione del tampone, concentrazione di perossido di idrogeno, proprietà del ligando o fotolisi possono causare differenze di ossidazione tra il controllo e gruppi sperimentali che creano ambiguità negli studi differenziali HOS. L’aggiunta della dosimetria radicale in tempo reale consente la regolazione dell’effetto ▪carico OH e quindi aumenta la confidenza e la riproducibilità durante un esperimento HRPF. L’uso della dosimetria radicale nell’FPOP è stato descritto altrove23,24,25, ed è ulteriormente discusso in dettaglio in una recente pubblicazione26. Qui descriviamo l’uso di un nuovo sistema di fotolisi flash e dosimetria in tempo reale per etichettare l’apo-mioglobina equina (aMb), confrontando i livelli di ossidazione peptidica in un esperimento FPOP con quello ottenuto quando si utilizza un laser ad eccimeri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi passaggi critici per garantire una corretta etichettatura delle proteine durante qualsiasi esperimento HRPF. In primo luogo, vengono selezionate una portata appropriata e una velocità di infiammamento della sorgente per assicurarsi che ogni bolo del campione sia irradiato una volta. Ciò garantisce che la proteina sia esposta a un singolo bolo di nuovo ▪OH. Una volta che una proteina viene ossidata, la struttura proteica di ordine superiore può essere alterata. Per essere sicuri che la stru…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 e R44GM125420).
Materials
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | any brand is sufficient |
| 50 µL SGE Gastight Syringes | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolumn (0.75 mm X 150 mm, 2 µm) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomyoglobin | Sigma-Aldrich | ||
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 022625501 | |
| Delicate Task Wipers | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-100 | any 30% hydrogen peroxide is sufficient |
| Methionine amide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer | other high resolution instruments (e.g. Q exactive Orbitrap or Orbitrap Fusion) can be used |
| Pierce Trypsin Protease, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1" x 1/32” | Molex | 1068680064 | any capillary tubing cutter is sufficient |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water with 0.1% Formic Acid (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
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