Array-Tomographie-Workflow zur gezielten Erfassung von Volumeninformationen mittels Rasterelektronenmikroskopie

Die folgenden Beispiele sollen die Vielseitigkeit der empfohlenen Workflows demonstrieren. Die Fallstudienillustrationen sind Projekte, bei denen wir Schwierigkeiten hatten, mit anderen Techniken zufriedenstellende Ergebnisse zu erzielen. Wir haben Uns für Drosophila adult entschieden, um typische Herausforderungen zu veranschaulichen, denen man bei zahlreichen Probentypen begegnen kann. Dieses röhrenförmige Organ von etwa 6 mm Länge, 500-1000 μm Im Querschnitt, ist in verschiedene Regionen mit einer einzigartigen Funktion und zellulären Zusammensetzung unterteilt (Abbildung 4A)33. Je nach Schnittausrichtung variieren die Abmessungen des Darmprofils und sein Aussehen auf dem Abschnitt. Entweder quer oder längs orientierte Abschnitte sind relativ groß, und nur ein Paar kann auf einem einzigen TEM-Gitter platziert werden (Abbildung 2F). Nur ein kleiner Teil des Gewebes kann im FIB abgebildet werden, und für das SBF-REM ist die Schwierigkeit ähnlich wie bei allen inhomogenen Proben. AT bietet einen effizienten Kompromiss für die Analyse solcher Proben und die flache Einbettung erleichtert die ROI-Lokalisierung. Das sorgfältige Trimmen des Harzüberschusses um den ausgewählten Bereich (Abbildung 4B) ist wichtig für die effiziente Sammlung der Arrays aus dem relevanten Bereich (Abbildung 4C). Hunderte von Abschnitten können auf einem einzelnen Wafer nacheinander oder zufällig gesammelt werden (Abbildung 4D). Abhängig von der Forschungsfrage erfordert das Stichprobenscreening und die Probenbeschaffung eine andere Strategie, die wir willkürlich in mehrere Szenarien unterteilt haben. Um verschiedene vorgestellte Szenarien gezielter zu veranschaulichen, wählten wir mehrere Fallstudien aus den verschiedenen Forschungsprojekten aus. Analyse zahlreicher zufällig verteilter großer Strukturen im Bereich von 1-10 μm (Abbildung 4E)Häufig werden ultrastrukturelle Daten benötigt, um eine Hypothese zu validieren, die sich aus mehreren experimentellen Ansätzen ergibt und einen Standard- und einen experimentell veränderten Zustand vergleicht. In diesen Fällen werden in der Regel mehrere Abschnitte nach dem Zufallsprinzip auf Rastern gesammelt und überprüft, um die Interessengebiete zu lokalisieren und abzubilden. Diese Taktik ist in der Regel weniger systematisch und auf eine kleine Anzahl von analysierten Abschnitten beschränkt. Wir empfehlen, Übersichten von Dutzenden/ Hunderten von Abschnitten mit mittlerer Auflösung aus einem bestimmten Farbband aufzunehmen (Abbildung 4D). Für typische Abschnitte von 70 nm umfassen 200 Abschnitte etwa 14 μm, die zahlreiche Zellen enthalten, die entweder ganz oder teilweise innerhalb einer halben Stunde abgeschlossen sind. Im ersten Schritt wird die niedrig aufgelöste Übersicht über das gesamte Farbband aufgezeichnet, und die Übersicht hilft, die Abschnitte wegzulassen, die Vorbereitungsartefakte (z. B. Falten, Schmutz) zeigen. Danach kann die Erfassung manuell oder automatisch direkt an ausgewählten Teilen des Schnitts oder einem ganzen Schnitt durchgeführt werden, wobei Einzel- oder Mosaikbildgebung verwendet wird, gefolgt von Stitching (Abbildung 4E). Danach können Bilder aus dem ausgewählten Bereich mit hochauflösenden Parametern aufgenommen werden. Beispielsweise können Mitochondrien, Kerne und Mikrovilli von einer solchen statistisch verbesserten Methode profitieren (Abbildung 4Ei-iii). Analyse mehrerer kleiner, spärlich verteilter Strukturen im Bereich von 500-1.000 nm (Ergänzender Film 1)In diesem Szenario kann der ROI nicht einfach in einem Übersichtsscan mit geringer Vergrößerung identifiziert werden, und es werden hochauflösende Bilder benötigt. In herkömmlichen TEM-Proben ist das mühsame Vergrößern und Verkleinern des Abschnitts notwendig, bis das erforderliche Merkmal gefunden ist. Oft ist die Abbildung mehrerer unabhängiger Orte in mehreren Proben statistisch relevanter als die Erzeugung eines einzelnen großen Volumens. In solchen Fällen wächst die Komplexität der manuellen Erfassung exponentiell. Obwohl mehrere TEM-Lösungen die automatische Erfassung oder das Screening mehrerer Gitter ermöglichen, machen die Größe des Netzes und die Herausforderungen bei der seriellen Abschnittierung den Ansatz häufig für viele Stichproben inkompatibel. Für ähnliche Fälle generieren wir eine vollständige Karte mit mittlerer Auflösung eines Gesamt-ROI in mehreren Abschnitten mit einer Auflösung, die ausreicht, um die interessierenden Strukturen zu identifizieren. Während dieses seitlichen Screening-Schritts ist es ratsam, mehrere Abschnitte gleichzeitig zu springen, um bei zufälliger Annäherung zumindest einen Teil der interessierenden Struktur zu treffen. Dies hängt weitgehend von den Gesamtabmessungen der Struktur ab: Wenn z. B. die Gesamtgröße der Struktur 500 nm beträgt und die Abschnitte 50 nm dick sind, enthalten mindestens neun aufeinanderfolgende Abschnitte in einer Reihe wahrscheinlich einen Teil der interessierenden Struktur. Auf diese Weise soll das Überspringen von 6-7 Abschnitten effizient sein, um viele verschiedene Arten von Strukturen in mehreren Bereichen zu finden. Die automatische Erfassung der aufgelösten Mosaikkarten ausgewählter Abschnitte ermöglicht ein sorgfältiges Screening dieser Abschnitte nach ihrer Erfassung. Sobald eine solche hochauflösende Karte erfasst ist, können mehrere ROIs ausgeschnitten oder verwendet werden, um zusätzliche lokale Bildgebungsbereiche auf ROIs zu definieren (Supplementary Movie 1). Golgi, Zentriolen, Verbindungen, Mikrotubuli, verschiedene Arten von Vesikeln sind gute Beispiele für die Strukturen, die von diesem Szenario profitieren könnten (Supplementary Movie 1). Analyse spärlich verteilter großer ROIs in großen Stichproben (Abbildungen 4F-4H)Dieses Szenario beinhaltet seltene Ereignisse, die häufig als “eine Nadel im Heuhaufen” beschrieben werden, bei denen das Problem nicht in der ROI-Identifizierung, sondern in seiner Lokalisierung liegt. Für viele Proben ist ein korrelativer Ansatz keine gültige Option, doch häufig hat der ROI eine aufschlussreiche Ultrastruktur und kann, wenn er lokalisiert ist, mit hoher Zuverlässigkeit identifiziert werden. Für diese Proben ist es wichtig, eine mehrstufige Erfassung anzuwenden, beginnend mit den vorgesiebten Proben mit Dutzenden bis Hunderten von Abschnitten mit mittlerer Auflösung. In der hier verwendeten Software gibt es zwei verschiedene Strategien, um Bildsätze aus mehreren Abschnitten zu erhalten: Aufnahme der Vorschaubilder mit höherer Auflösung oder Erfassung eines Array-Kachel-Sets mit geeigneten Einstellungen (Abbildung 4F). Verschiedene spezialisierte Zelltypenim Drosophila-Darm sind zufällig verteilt (z. B. Stammzellen, enteroendokrine Zellen) und bei zufälliger Orientierung dünn geschnitten. Sie können jedoch visuell unterschieden werden, nachdem die mit hochauflösenden Parametern erhaltenen Bilder entweder aus einzelnen Abschnitten oder als Sammlung von Serienbildern gewonnen wurden (Abbildung 4G). Nach der Ausrichtung können die Stacks mit verschiedenen Softwarelösungen gerendert werden (Abbildung 4H, Supplementary Movie 2). Szenario 1: Intestinale Organoide (Abbildung 5A)Organoide entwickeln sich schnell zu einem der modernsten Werkzeuge der modernen Lebenswissenschaften. Dieses nahezu physiologische 3D-Stammzell-abgeleitete Organmodell ermöglicht eine genaue Untersuchung einer Reihe von biologischen In-vivo-Prozessen, einschließlich Gewebeerneuerung, Reaktion auf Medikamente und regenerative Medizin. Die kürzlich eingeführten Mini-Darm-Röhrchen34 eröffnen eine neue Generation der Organoidtechnologie, die der In-vivo-Gewebephysiologie, der Zelltypzusammensetzung und der Homöostase sehr ähnlich ist und breite Perspektiven für die Krankheitsmodellierung, die Wirt-Mikroben-Interaktion und die Wirkstoffforschung ermöglicht. Wenn jedoch eine ultrastrukturelle Charakterisierung erforderlich ist, kann die Lokalisierung verschiedener Zelltypen in so großem Gewebe unter Verwendung von Zufallsproben eine Herausforderung darstellen. Auch bei variablen “Infektionstests” ist es wichtig sicherzustellen, dass die Analyse verschiedene Entwicklungsstadien aufdeckt, die das Gewebe beeinflussen. Für solche Studien ist die statistisch signifikante Abdeckung der Stichprobe von zentraler Bedeutung, aber mit dem traditionellen TEM-On-Grid-Ansatz schwer zu erreichen. AT-Szenario 1 ist in solchen Fällen von Vorteil: Viele sequentielle Abschnitte können auf einem Wafer erzeugt werden (Abbildung 5Aii) und mit Niedrigauflösungsparametern gescreent werden, um die allgemeinen Interessengebiete zu lokalisieren (Abbildung 5Aiii; Pfeile). Diese Bereiche können für weitere Analysen mit erweiterten Erfassungsparametern anvisiert werden (Abbildungen 5Aiv und Abbildung 5Av). Wenn eine relevante Struktur erkannt wird (typischerweise ein Cluster von 5-10 Abschnitten einmal pro 100-300 Abschnitte), ist es einfach, sich auf jede der interessierenden Strukturen zu konzentrieren und einzelne Bilder manuell zu erfassen oder die Automatisierungsfunktionen zu verwenden, um Bildvolumina über mehrere Abschnitte hinweg zu erfassen. Szenario 2: Drosophila pupal notum ( Abbildung5B)Die Untersuchung der Zellteilung und der Mechanismen, die die Progression durch den Zellzyklus steuern, ist entscheidend, um sowohl Standard- als auch veränderte Prozesse in mehrzelligen Organismen zu verstehen. Vorhandene Informationen stammen häufig aus einzelligen Systemen; Dieser Lösung fehlt jedoch der kritische Kontext der 3D-Interaktionen zwischen den Zellen in einem Gewebe. Eine einzellige Monoschicht des Notums, des sich entwickelnden Rückens der Drosophila-Larve, ist ein perfektes Modell für die Interaktion zwischen den Epithelzellen im Allgemeinen und der Zellteilung im Besonderen35. Es ist ein etabliertes Modell für molekulare und zelluläre Interaktionsstudien, das die Kombination der durch Fluoreszenzmikroskopie und genetische Manipulationen verfügbaren Daten nutzt. Die Abszission, der letzte Schritt der Zellteilung, gewährleistet die endgültige Trennung zwischen zwei sich teilenden Zellen, und die Charakterisierung der strukturellen Veränderungen, die während der Abszise auftreten, ist für unser Verständnis der Mitose unerlässlich. Allerdings sind mitotische Unterteilungen im Notum auf ultrastruktureller Ebene nicht leicht zu lokalisieren: Die Zellen sind im Vergleich zur Abszischzone relativ groß (Abbildung 5B). Das Verhältnis zwischen der Gesamtgröße der Abszisionszone und der Oberfläche des abzudeckenden Abschnitts ist groß (Abbildung 5Bi). Obwohl es möglich ist, die Abszisionszone mit den Methoden TEM oder SBF-SEM36zu lokalisieren, ist die Aufgabe mühsam. Mit diesem Szenario können die automatischen Übersichtsbilder mittlerer Auflösung der Sprünge von 20-40 Abschnitten zur Lokalisierung der sich teilenden Zellen verwendet werden (Abbildung 5Bii). Wenn solche Zellen identifiziert werden, dienen die Abschnitte als Anker für eine genauere Untersuchung der Abschnitte in der Nähe, und zahlreiche sich teilende Zellen können gefunden und für weitere Analysen ausgewählt werden. Auf diese Weise kann die Abszisionszone in ihrer Gesamtheit lokalisiert und abgebildet werden (Abbildung 5Biii). Je nach Fragestellung können einzelne hochauflösende Bilder oder 3-7 Bildsequenzen gesammelt werden, um die Tiefe der Struktur abzudecken (Abbildung 5Biv). Szenario 3: Tanyzytenneuronen der Maus (Abbildung 5C)Die Maus bietet ein gut etabliertes Modell für die Entwicklung des Gehirns und ist auf verschiedenen Ebenen gut dokumentiert, auch durch EM. Obwohl verschiedene automatisierte serielle Block-Face-Methoden ausgiebig verwendet wurden, um Hirngewebe zu untersuchen, gibt es Fälle, in denen AT besser angepasst ist, um die notwendigen Daten zu sammeln. Der Hypothalamus ist ein etabliertes neurowissenschaftliches Modell, ein Teil des Gehirns, der mehrere neuronale Funktionen enthält. Hypothalamische Tanyzyten stellen eine bestimmte Untergruppe von ependymoglialen Zellen dar, die den Boden des dritten Ventrikels auskleiden, mit ungewöhnlich langen Prozessen (bis zu 300 μm) und großen Endfüßen (~ 5 μm)37. Dies macht sie für die Analyse mit TEM- oder FIB-Methoden unpraktisch. Die Aufgabe wird noch komplizierter, wenn mehrere unabhängige Tanyzyten lokalisiert und analysiert werden müssen. Einer der Ansätze, um diese Aufgabe zu erleichtern, kann semi-korrelatives Targeting sein, bei dem die Fluoreszenzkarte aus den fluoreszenzmarkierten Proben erhalten wird, bevor sie für EM fixiert und eingebettet wird. Der Schnitt wird auf der erfassten Fläche durchgeführt, indem die Positionsinformationen aus der Fluoreszenzprobe und der flachen eingebetteten Kunststoffnachbildung kombiniert werden. Danach kann das AT-Szenario 3 verwendet werden: Die high-level Übersichtsmosaikbilder werden generiert, um die Regionen mit Tanyzyten-Endfeetenclustern zu enthüllen. Anschließend werden Automatisierungsfunktionen in der Software verwendet, um die Erfassung von Sequenzen der Bilder aus einem oder mehreren Bereichen in einem einzelnen Bild- oder Kachelmodus einzurichten. Diese Bilder können separat analysiert, als ausgerichtete Stapel oder danach gerendert werden. Die Leistungsfähigkeit der AT-Methode ermöglicht das relativ mühelose “Upgrade” von Daten von 2D auf 3D: Die Karten sind aus der Primärerfassung verfügbar, und die Volumina können aus dem ausgewählten Gebiet und seiner Umgebung bezogen werden. Der resultierende Stapel kann ausgerichtet und anschließend gerendert werden. Es ist wichtig, im Voraus zu bestimmen, welche Auflösung und Bildqualität erforderlich sind, um ROIs zu finden. Die Bildgebung sollte es ermöglichen, die ROIs zu erkennen, aber nicht über diesen Wert hinaus, da die Erfassungszeit proportional zur Pixelverweilzeit und dem umgekehrten Quadrat der Pixelgröße skaliert wird. Abbildung 1: Herausforderungen bei der EM-Probenvorbereitung und Volumenerfassung. (A) Der Verlust von Fluoreszenz und Schrumpfung geschieht aufgrund einer hohen Schwermetallkonzentration und Dehydration während der Probenvorbereitung. (i) Eine schematische Zeichnung einer Probe, die unter LM (ii) beobachtet wurde, dieselbe Für EM vorbereitete Probe, die völlig undurchsichtig wird und etwa 10% ihres Volumens verliert. (B) Die Probeneinbettung erfolgt typischerweise unter Verwendung von Epoxid- oder Acrylharzen. Traditionelle Blöcke (i) können erfolgreich für homogene Proben verwendet werden, die keine bestimmte Ausrichtung erfordern. Flache Blöcke (ii) sind hilfreich, wenn es wichtig ist, unter dem Mikroskop einen präzisen Bereich zu zielen und zu orientieren, der zum Schneiden bestimmt ist, z. B. in inhomogenen Proben oder korrelativen Mikroskopieverfahren. (C) Vom gesamten Probenvolumen wird nur ein begrenzter Bruchteil auf einem einzigen 50-nm-Schnitt dargestellt, der ein 2D-Bild einer 3D-Probe liefert, häufig in einer unbekannten Ausrichtung. (D) Um das Problem der Aufzeichnung zu großer Volumina im Vergleich zum präzisen Targeting zu veranschaulichen, haben wir drei konzentrische Würfel mit den Flächen von 1000, 500 und 50 μm ausgewählt, die so organisiert sind, dass sie eine hypothetische Probe von 1000 x 500 x 500 x μm (dunkel kastanienbraun) enthalten. Wenn solche hypothetischen Probenwürfel gründlich mit 50-nm-Scheiben geschnitten werden, um das gesamte Volumen abzudecken, sind insgesamt 20.000, 10.000 und 1.000 Scheiben sowie 800 TB, 100 TB und 100 GB erforderlich (Abbildungsauflösung 5 nm x 5 nm x 50 nm, 8-Bit-Daten). Dies zeigt, wie wichtig es ist, die Erfassung von EM-Daten nur zu planen, um das erforderliche Mindestvolumen zu erreichen. (E) Die Abdeckung einer großen Probenoberfläche in hoher Auflösung stellt ein ähnliches Problem dar wie bei großen Mengen. Das Kacheln mehrerer hochauflösender Bilder in einem ist eine hilfreiche Lösung für ein solches Problem. Um jedoch eine Fläche von 1 mm x 1 mm mit dem Rahmen 2024 x 1048 in 10.000-facher Vergrößerung abzudecken, ist eine große Anzahl von Fliesen erforderlich, die schwierig zu nähen sein können. Wenn Abschnitte während des Schneidens variabel komprimiert oder verzerrt werden, werden die resultierenden Datenstapel fast unmöglich auszurichten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Der Arbeitsablauf für die direkte Generierung der Arrays von Abschnitten auf großem Träger. (A) Für das enge Trimmen mit dem Trimmwerkzeug werden Blöcke im Mikrotomhalter befestigt. Dieser Schritt hilft, parallele Seiten eines Blocks sicherzustellen und reduziert auch leeres Harz um die Probe herum. (B) Ein modifiziertes Messer für den Erwerb von AT-Abschnitten. Ein großes Boot erleichtert den Transfer der Abschnitte und deren Manipulation während des Probenschnitts und des Transfers auf dem Träger. Ein großes Becken ermöglicht die Manipulation der Abschnitte; Das Entwässerungssystem begrenzt die Bewegung der Bänder während des Entwässerungsschritts, der flache Boden macht die allmähliche Trocknung des Trägers zuverlässig. (C) Das Messer, bereit zum Schneiden mit einem glühentladungen Wafer am Boden des Beckens und Wasser an den Rändern. Die Konstruktion des Messers hält die Nadel eingebettet, ohne in die Halterung einzugreifen. (D) Array-Generierung, Draufsicht auf den Mikrotomschnittbereich. (i) Die ersten Abschnitte sind in der Regel leicht zu erhalten, da sie aneinander haften und ein regelmäßiges Band bilden. (ii) Wenn dem Menüband weitere Abschnitte hinzugefügt werden und es länger wird, verliert das Band seine Stabilität und krümmt sich häufig. Es ist wichtig, die Sequenzspuren in Vorbereitung auf den Bildaufnahmeschritt nacheinander zu organisieren. (iii) Wenn ein Band aus Abschnitten die gewünschte Länge erreicht, wird es mit einer Wimper vorsichtig von der Messerkante gelöst. iv) Wasser aus dem Becken abgelassen wird; der Wafer bleibt im Inneren, bis er vollständig lufttrocken ist. Dieser Schritt ist wichtig, da er hilft, die Abschnitte zu begradigen und die Bildung der Mikrofalten zu vermeiden. Die Waffel wird bei 60°C für mindestens 30 min in den Ofen gestellt, um die Abschnitte auf dem Träger zu befestigen. (E) Beispiel Wafer mit den übertragenen Abschnitten. Obwohl es bequem ist, gerade und genaue Bänder zu erhalten, verhindern tatsächliche Proben in den meisten Fällen die Bildung solcher idealen Bänder. Dennoch sind selbst “schlampige” Bänder für die große Anzahl von Fällen sehr informativ, und die Bedeutung des “ordentlichen” Bandes hängt von einer Forschungsstrategie ab, für die die Abschnitte gesammelt werden. Maßstabsleiste 1 cm. (F) Beispiel Schlitzraster mit den seriellen Abschnitten. Selbst wenn viele Abschnitte auf einem Gitter gesammelt werden, ist es immer noch ein winziger Bruchteil dessen, was auf einem einzigen Wafer gesammelt werden kann. Die Fähigkeit, die Übertragung der Abschnitte auf einem Gitter (insbesondere Schlitzgitter) zu beherrschen, stellte einen erheblichen Engpass für die Beherrschung der elektronenmikroskopischen Probenvorbereitung dar. Maßstabsbalken 500 μm. (G) Unabhängig davon, welche Schnitterfassungsmethode verwendet wurde, liegt die Stärke des AT-Ansatzes in der relativ einfachen Erzeugung sequenzieller Schnitte im Vergleich zur Netzabscheidung. Betrachtet man einen 1000 μm x 500 μm Probenblock, ist es kein Problem, etwa 100 Schnitte auf einen 2 cm x 4 cm großen Wafer (i) zu montieren. Die Abschnitte gleicher Größe in einem Schlitzraster passen maximal (ii) in nur drei Abschnitte/Raster. Wir stellen ein skaliertes Bild zur Verfügung, um zu zeigen, wie viele Raster erforderlich sind, um die gleiche Anzahl von Abschnitten abzudecken, ohne die Schwierigkeit zu erwähnen, serielle Abschnitte im Raster zu sammeln. Maßstabsleiste = 1 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3:Kritische Schritte des Array-Tomographie-Workflows. Schematische Darstellung des Workflows für die unbeaufsichtigte Erfassung von hochauflösenden Bildstapeln. Alle vorbereitenden Schritte sind automatisiert (grüne Zahnradsymbole) und erfordern keine manuellen Aktionen, Abschnitt für Abschnitt. Bildstapel können in jeder Bildanalysesoftware ausgerichtet werden, die eine automatische starre oder affine Ausrichtung ermöglicht. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Drei Akquisitionsszenarien mit Drosophila Adult Gut als Demonstrationsmodell. (A) Zeichnung eines sezierten Drosophila-Mitteldarms mit drei Hauptregionen, die durch verschiedene Farben gekennzeichnet sind: vordere, mittlere und hintere. (B) Getrimmter Flachblock, in dem ein Darm für Querschnitte ausgerichtet ist. Beachten Sie, dass die leere Harzmenge sorgfältig um das Gewebe herum balanciert wird, das den interessierenden Bereich (weißes Rechteck) enthält. (C) Transversale Serielle Abschnitte schwimmen auf der Wasseroberfläche im Becken des AT-Messers. Alle Bilder wurden im Sekundärelektronen-REM-Modus mit dem Spiegeldetektor mit dem inversen Kontrast aufgenommen. (D) Zusammengefügtes Mosaikbild von transversalen seriellen Schnitten auf einem Wafer. Maßstabsbalken ist 1000 μm. (E) Querschnitt durch Drosophila Darm. Maßstabsleiste 20 μm. Das Bild ist ein zusammengefügtes Mosaik aus 7 x 7 Mittelklassebildern. Insets – Bilder mit höherer Vergrößerung und Auflösung der spezifischen Regionen von Interesse: (ii) Kern, (iii) Pinselrand und (i) Mitochondrien. Maßstabsleiste 5 μm für alle. (F) Ein Mittelbereichsbild eines Querschnitts durch den Darm, der auf den Ort der sich entwickelnden Zellen abzielt (quadratisch). Maßstabsbalken ist 20 μm. (G) Das zielgerichtete Array von seriellen Schnitten, die basierend auf der Fläche gesammelt werden, die während der Analyse des in Panel F vorhandenen Abschnitts lokalisiert wurde. Maßstabsbalken beträgt 10 μm. (H) Das 3D-Modell wird basierend auf der 50-Schnitt-Stapelsequenz gerendert, die aus der gezielten seriellen Erfassung in Panel G gewonnen wurde. Abbildung 5: Fallstudien für die AT-Anwendungsszenarien. (A) Lokalisierung verschiedener Zellstrukturen im Darmorganoid. (i) Eingebetteter Silizium-Mikrochip. Maßstabsleiste = 200 μm. (ii) Ein zusammengefügtes Mosaikbild von 127 Querschnitten durch den zentralen Teil des Chips. Maßstabsbalken = 1500 μm (iii) Vier niedrig aufgelöste Bilder eines kompletten Querschnitts durch den Teil des Darmorganoids. Pfeile zeigen auf den potenziellen Standort von Interesse. Der Maßstabsbalken beträgt 20 μm. (iv) Verschiedene ROIs, die auf niedrig aufgelöste Mikroaufnahmen abzielen, die für weitere Analysen ausgewählt wurden. Maßstabsbalken = 10 μm. (v) Hochauflösendes Bild der infizierten Zelle von Interesse. Die Analyse des gleichen Bereichs in den angrenzenden Abschnitten kann bei Bedarf gezielte 3D-Informationen liefern. Skalenbalken = 5 μm. (B) Mittelkörperlokalisation in Drosophila melanogaster pupal notum. (i) Eine schematische Darstellung einer sezierten Drosophila-Puppe. Notum exponiert für die Dissektion (beige) nach Entfernung des Teils der schützenden Kutikula (braun). Die schwarze Linie bezeichnet die Schnittrichtung (ii) Ein Querschnitt durch den im Diagramm dargestellten Bereich. Das Bild kombiniert 3×7 sequentiell aufgenommene hochauflösende REM-Bilder, die zu einem Mosaikpanel zusammengefügt wurden. Das schwarze Rechteck grenzt den Bereich ab, der eine teilende Zelle enthält. Der Maßstabsbalken beträgt 15 μm. (iii) Ein vergrößertes Bild auf der Trennzelle aus Tafel ii. Bei dieser Vergrößerung und Auflösung ist der Mittelkörper sichtbar (weiße Pfeile). Der gesamte Abschnitt wird analysiert, um die sich teilenden Zellen zu finden. Das Springen zwischen verschiedenen Bändern von Abschnitten in 20-30 Abschnittsintervallen während des lateralen Screening-Schritts ermöglicht es, zahlreiche sich teilende Zellpaare zu lokalisieren. Der Maßstabsbalken beträgt 5 μm (iv), wenn eine sich teilende Zelle lokalisiert ist, sequentielle Bilder des Mittelkörpers, die aus vier Abschnitten um den Mittelkörper gesammelt werden, die durch ein gelbes Quadrat in der Tafel (iii) begrenzt sind. Der Maßstabsbalken beträgt 1 μm. (C) Tanyzyten-Endfeetenlokalisation im Maushypothalamus. (i) Fluoreszenzbild einer Vibratomscheibe. Tanycyten exprimieren tdTomato fluoreszierendes Protein (rot). Ein weißes Rechteck grenzt den interessierenden Bereich ab. Maßstabsbalken 500 μm. (ii) Derselbe für EM vorbereitete Vibratomabschnitt wird sorgfältig um den interessierenden Bereich herum getrimmt – basierend auf der indirekten Korrelation der Fluoreszenzinformationen aus Panel (i). Die gepunktete weiße Linie stellt den Bereich der ultradünnen Schnitte dar. Maßstabsleiste beträgt 50 μm für beide Panels. iii) Querschnitt durch die Vibratomscheibe im interessierenden Bereich. Das SEM-Mosaikbild besteht aus 75 zusammengefügten Bildern. Mehrere Abschnitte werden durch seitliches Screening anvisiert und mit ähnlichen Parametern abgebildet. Die Abschnitte werden “offline” analysiert, um den ROI – die Tanyzytenendfüße – zu finden. Das schwarze Rechteck stellt den Bereich dar, der die Tanyzytenendfüße enthält. Dieser Abschnitt dient als Anker für weitere Analysen. Maßstabsbalken ist 15 μm. (iv) Hochauflösendes, hochvergrößertes Bild von Tanyzyten-Endfüßen, die ein Blutgefäß umgeben. Nach der anfänglichen Lokalisierung des ROI auf einem Abschnitt wird die Z-Sequenz aus den angrenzenden Abschnitten stromaufwärts zum Ankerabschnitt (Panel iii) gesammelt. Maßstabsleiste 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 6: Probleme bei der Ultramikrotomie, Schnittentnahme und Schnittlagerung können zu Artefakten führen. (A) Gehirnprobenschnitte auf einem Wafer. Der größte Teil des leeren Harzes löste sich vom Gewebe und faltete sich auf sich selbst (Sepia). Gestrichelte schwarze Box bezeichnet einen Bereich, der verwendet wird, um den gesamten Abschnitt zu enthalten. Maßstabsbalken 500 μm. (B) Eine kleine, lokale Falte auf der Oberfläche eines 50 nm dicken Zebrafischabschnitts. Maßstabsbalken 1 μm.(C)Messermarkierung auf der Oberfläche eines 70nm Maushirnschnitts. Mensurstab 5 μm. (D) Das Haar (Sternchen) auf der Oberfläche des Wafers, das teilweise einen Zebrafisch-Muskelabschnitt bedeckt. In Gelb wird das Gewebe für die Analyse anvisiert. In Rosa eine Zelle, die als Referenz für die Größe des betroffenen Bereichs dient. Maßstabsleiste 50 μm. (E) Zebrafisch-Notochord mit Falten unten rechts (schwarze Pfeile), wo dichtes Nervengewebe (blau beschattet) an weicheres Muskelgewebe und leeres Harz (schwarze Pfeile) grenzt. Maßstabsleiste 10 μm. (F) Volumensegmentierung eines Stapels von 50 Bildern wie in E, was zeigt, dass dieser Bereich in den meisten Abschnitten Falten aufwies. Gestricheltes Polygon umreißt die Fläche, die in der G. Maßstabsleiste 10 μm angezeigt wird. (G) XY-Ansicht der gleichen Volumensegmentierung wie in F, wobei die Falten als kurze schwarze Striche in der rechten Hälfte des Blocks angezeigt werden. Beachten Sie, dass die Ausrichtung des Stapels in den verbleibenden Teilen des Gewebes nicht durch die Falten beeinflusst wird. Maßstabsleiste 5 μm. (H) XZ Projektion des gleichen Bereichs wie in G, zeigt die Falten in allen 50 Abschnitten. Maßstabsleiste 5 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Ergänzungsfilm 1: Ein hochauflösendes Montagebild eines Querschnitts durch Drosophila anterior middarm. Mosaikbild eines invertierten SE-MD SEM-Bildes. 352 separate Bildkacheln wurden automatisch mit einer Auflösung von 5 nm erfasst und zusammengefügt, um den gesamten Querschnitt darzustellen. Es ist möglich, für weitere Details zu zoomen und eine umfassende Abdeckung der Daten mit demselben Bild zu erhalten. Tight Junctions, Mikrotubuli, verschiedene Arten von Vesikeln können beim Heranzoomen sein. Maßstabsleiste ist 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen. Ergänzender Film 2: Drosophila Darmzellen Rendering. Fünfzig ausgerichtete Mosaikbilder der Abschnitte im Bereich der sich teilenden Darmzellen. IMOD-Rendering der Zellränder (blau, türkis und orange) und Kerne (weiß). Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen. Ergänzende Materialien. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.