We beschrijven de voorbereiding van linten van seriële secties en hun verzameling op grote overdrachtsondersteuning voor gebruik als Array Tomography-monsters, samen met geautomatiseerde beeldvormingsprocedures in een scanning elektronenmicroscoop. Het protocol maakt screening, retrieval en gerichte beeldvorming van lokale, zeldzame gebeurtenissen en de verwerving van grote gegevensvolumes mogelijk.
Elektronenmicroscopie wordt toegepast in de biologie en geneeskunde voor beeldvorming van cellulaire en structurele details met nanometerresolutie. Historisch gezien gaf Transmission Electron Microscopy (TEM) inzicht in cel ultrastructuur, maar in het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van moderne Scanning Electron Microscopes (SEM) de manier van kijken in de cellen veranderd. Hoewel de resolutie van TEM superieur is wanneer structurele details op eiwitniveau nodig zijn, is SEM-resolutie voldoende voor de meerderheid van de celbiologiegerelateerde vragen op organelniveau. De technologische vooruitgang maakte automatische volume-acquisitieoplossingen mogelijk, zoals Serial block-face imaging (SBF-SEM) en Focused ion beam SEM (FIB-SEM). Niettemin blijven deze methoden tot op de dag van vandaag inefficiënt wanneer de identificatie en navigatie naar interessegebieden cruciaal zijn. Zonder de middelen voor nauwkeurige lokalisatie van doelgebieden vóór beeldvorming, moeten operators veel meer gegevens verzamelen dan ze nodig hebben (in SBF-SEM), of, erger nog, veel rasters voorbereiden en ze allemaal in beeld brengen (in TEM). We stellen de strategie voor van “laterale screening” met behulp van Array Tomography in SEM, die de lokalisatie van interessegebieden vergemakkelijkt, gevolgd door geautomatiseerde beeldvorming van de relevante fractie van het totale monstervolume. Arraytomografiemonsters worden bewaard tijdens het afbeelden en kunnen worden gerangschikt in sectiebibliotheken die klaar zijn voor herhaalde beeldvorming. Er worden verschillende voorbeelden getoond waarin laterale screening ons in staat stelt om structurele details te analyseren die ongelooflijk moeilijk toegankelijk zijn met een andere methode.
Ondanks het belang van EM-gerelateerde technieken, houdt de inspanning die nodig is om ze onder de knie te krijgen het hele veld beperkt tot een klein aantal specialisten. Een belangrijke moeilijkheid is het identificeren en ophalen van een regio van belang (ROI) in de monsters die voor EM zijn bewaard. Het uiterlijk van hetzelfde monster verschilt aanzienlijk bij analyse door optische microscopie en na verwerking voor EM-observatie. De veranderingen voor chemisch bereide monsters omvatten de anisotrope monsterkrimp na de uitdrogingsstappen (~ 10% in elke dimensie) en het verlies van fluorescentie bij gebruik van osmium in het fixatie- en kleuringsprotocol(figuur 1A). Voor de ultradunne sectie worden de monsters ingebed in epoxy- of acrylharsen met behulp van verschillende strategieën(figuur 1B). Voor een succesvol resultaat van dit preparaat moet het gehele monster worden gefractioneerd in stukken die niet groter zijn dan 1 mm x 1 mm. Om te voldoen aan de vereisten van de standaard Transmission Electron Microscopy (TEM) observatievoorwaarden, wordt dit kleine deel van het monster verder gesegmenteerd tot plakken van 50-150 nm dik. De resulterende grijswaardenbeelden tonen weefselorganisatie en organelstructuur van een minuscule fractie van het gehele monster met meer detail dan enige andere microscopietechniek (figuur 1C). Een typische TEM-dataset biedt 2D-informatie, theoretisch geëxtrapoleerd om de processen te begrijpen die van nature voorkomen in een 3D-ruimte in cellen en weefsels. Figuur 1D toont de uitdaging van ultrastructurele volumes acquisitie: als een kubus van zijde 1.000 μm wordt doorsneden op een dikte van 50 nm, zijn 20.000 secties nodig om het hele volume te bedekken; voor een zijkubus van 500 μm zijn het 10.000 secties. Om een volume van 50 μm x 50 μm x 50 μm te dekken, kunnen 1.000 secties “slechts” nodig zijn. Het handmatig verkrijgen van dit volume is praktisch onmogelijk en uiterst uitdagend om uit te voeren met automatisering. Als we, naast de diepte van het monster, het volledige oppervlak van dergelijke hypothetische kubussen moeten bedekken, wordt de dekking van het oppervlak van 1μm 2 met een redelijke resolutie een ernstig logistiek probleem(figuur 1E). Terwijl voor de buitengewone grootschalige projecten, zoals connectomics-benaderingen, het grote aantal secties cruciaal is, vormt voor de meerderheid van de “alledaagse” EM-projecten het genereren van meer secties die nodig zijn voor de observatie een aanzienlijk nadeel.
Er zijn verschillende methoden om 3D ultrastructurele informatie te verkrijgen: serial sectioning Transmission Electron Microscopy (TEM), TEM tomography, Array Tomography (AT), Serial Block Face Imaging Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) en Focused Ion Beam Scanning Electron Microscopy (FIB-SEM). Belangrijkste verschillen tussen deze methoden zijn de sectiestrategie en of de beeldacquisitie gekoppeld is aan sectiegeneratie1. Bij seriële sectie-TEM worden sequentiële secties verzameld op sleufrasters, TEM-afbeeldingen worden gegenereerd uit deze reeksen en uitgelijnd2,3,4,5. In TEM-tomografie bieden kantelseries van 150-300 nm secties op een raster, en wanneer gekoppeld aan seriële secties, een zeer hoge resolutie, hoewel relatief kleine volumes6,7,8. De AT-benadering maakt gebruik van fysieke secties met diverse handmatige en semi-automatische manieren van sectieverzameling op relatief grote ondersteuning, zoals glazen afdekplaat, siliciumwafers of een speciale tape. Voor beeldacquisitie wordt de ondersteuning geanalyseerd in SEM, met verschillende beeldacquisitiestrategieën zijn beschikbaar9,10,11,12,13,14,15. Voor SBF-SEM wordt fysieke sectie bereikt met behulp van een mini-microtoom met een diamantmes dat direct in de SEM-kamer is geplaatst, waarbij het SEM-beeld wordt gegenereerd vanaf het oppervlak van het harsblok16,17,18,19. Voor FIB-SEM verwijdert de ionenbron dunne lagen van het monster, gevolgd door automatische beeldvorming van het blootgestelde oppervlak door de SEM20,21. TEM-tomografie en de AT genereren fysieke secties, die indien nodig opnieuw in beeld kunnen worden gebracht, terwijl FSBF-SEM en FIB-SEM de sectie na beeldvorming elimineren. Een recente combinatie van fysieke secties afgebeeld door een multi-beam SEM biedt een combinatie van methoden die het “bottleneck” -probleem van de snelheid van beeldacquisitie oplost22. Elk van deze technieken heeft een revolutie teweeggebracht in de manier waarop EM-gegevens kunnen worden verkregen en geanalyseerd, en elke benadering heeft zijn praktische effecten met betrekking tot een bepaalde onderzoeksvraag.
Gezien de aard van het preparaat en de schaal van de ultrastructurele dimensies, is het niet eenvoudig te voorspellen waar een specifieke doelstructuur zich in het monsterblok bevindt (Figuur 1D,E). Een oplossing voor de ROI-lokalisatie is het vastleggen van de beelden uit het hele blok met de gewenste resolutie vanaf het begin. De structuren van belang kunnen zich in het verkregen gegevensvolume bevinden wanneer ze niet van de microscoop verwijderd zijn. Acquisitietijd en gegevensverwerking in verband met deze strategie zijn problematisch. Het is wenselijk om de hoeveelheid geregistreerde gegevens te verminderen, vooral als de ROI’s veel kleiner zijn dan het weefselblok, d.w.z. als de objecten van belang specifieke soorten cellen zijn (geen hele organen). Verschillende correlatieve licht- en elektronenmicroscopietechnieken (CLEM) kunnen succesvol zijn wanneer de fluorescentie wordt bewaard en gelokaliseerd voor of na de bereiding binnen hetzelfde monster23,24,25,26,27,28,29. Niettemin zijn veel cellulaire structuren herkenbaar, zelfs zonder fluorescentiecorrelatie, alleen gebaseerd op de bekende ultrastructuur. Voor deze gevallen zijn we van mening dat laterale screening Array Tomography een balansafweging biedt tussen de inspanning die is geïnvesteerd in ROI-lokalisatie en de ultrastructurele informatiekwaliteit. Met behulp van deze strategie wordt binnen regelmatige tussenpozen een subset van secties op de wafer gescreend, die kunnen worden vastgesteld op basis van de grootte en aard van de ROI. Zodra ROI’s zijn gevonden, wordt gegevensverzameling opgezet in een continue reeks secties die beginnen voor en eindigen na de ankersectie, waarbij de relevante informatie op een gerichte manier wordt verzameld.
We presenteren protocollen voor AT die de acquisitie van regio’s of evenementen van belang in tal van secties vereenvoudigen en versnellen en beter uitgelijnde beeldvolumes opleveren. Laterale screening en multistep acquisitie produceren gegevens met een zeer hoge resolutie in precies gerichte regio’s. De procedure die we beschrijven, behandelt verschillende uitdagingen van 3D EM-gegevensverzameling, omdat deze voorziet in: compatibiliteit met een breed scala aan monsters zonder de workflow voor monstervoorbereiding fundamenteel te veranderen; gerichte lokalisatie voor sectie- en SEM-acquisities; minder tijd en moeite tijdens de installatie; beeldvorming van regio’s in meerdere secties met een betere uitlijning van de resulterende volumes; en een soepele stik- en uitlijningsprocedure om verschillende afbeeldingen samen te stellen tot een gestikt mozaïekbeeld. We kozen ervoor om de kracht van onze methode aan te tonen met verschillende voorbeelden van gepubliceerde en lopende projecten. Wij zijn van mening dat deze aanpak het genereren en verwerven van gerichte EM-gegevens aanzienlijk kan vergemakkelijken, zelfs voor onderzoekers met beperkte EM-ervaring.
Elektronenmicroscopie geeft inzicht in de ultrastructuur van de cellen en organismen, waarvoor het vaak wenselijk is om interessante structuren in hun 3-dimensionale context in beeld te brengen. Ondanks talloze EM-tactieken voor ultrastructurele analyse, is er nog steeds geen “gouden standaard” -oplossing. De belangrijkste reden is de grote verscheidenheid aan monsters, veel biologische vragen, die vaak een aanpak op maat vereisen. De voorgestelde AT-workflow is ontworpen om de tijd die nodig is voor monsterverwerking, gegevensverzameling, evaluatie en opslag te minimaliseren. Bovendien biedt het aangepaste mes een nuttig hulpmiddel om de acquisitie van arrays te vereenvoudigen. De compacte lay-out van secties op wafers is handig, zowel voor de observatie als de daaropvolgende opslag van de monsters. Deze opstelling maakt “Laterale screening” van monsters mogelijk door horizontaal van lint naar lint te gaan en slechts één sectie op elk te scannen, waardoor de tijd die nodig is om een ROI te lokaliseren aanzienlijk wordt verkort. Voorgestelde scenario’s voor gegevensverzameling vergemakkelijken het richten van kleine en willekeurig verspreide gebieden. Eenmaal gevonden, beperkt AT / SEM beeldvorming met hoge resolutie precies tot het volume van interesse, of het nu handmatig of met behulp van een automatische functie wordt uitgevoerd. AT voor beperkte volumes kan handmatig worden voltooid, waarbij de operator één voor één door het monster navigeert en beeldgebieden definieert. De geautomatiseerde module van de software biedt een flexibele beeldacquisitiestrategie voor beeldvorming van kleine gebieden op grote secties. De automatisering in deze software maakt het mogelijk om grote beelden met een hoge resolutie op honderden secties op te nemen, waardoor vergelijkbare volumes als SBFI worden bereikt. Het opnemen van overzichtsbeelden van alle secties vereenvoudigt de ROI-lokalisatie en vermindert de tijd die aan de microscoop wordt doorgebracht. Aangezien de secties niet worden geschaad tijdens het opnemen van overzichten en previews met een hogere resolutie, staat AT/SEM toe dat het monster wordt hergebruikt om verdere gegevens van andere ROI’s of met een hogere resolutie te verzamelen.
Beeldacquisitietijd is een van de belangrijkste (en duurste) aspecten van 3D EM en moet daarom worden overwogen in het experimentontwerp. Hoewel het niet verwonderlijk is dat het fotograferen van grote gebieden langer duurt dan het afbeelden van kleine gebieden, is het gemakkelijk om de impact te onderschatten: afhankelijk van de geselecteerde beeldvormingsparameters kan de acquisitietijd op elke sectie variëren van seconden tot uren. Kritieke beeldvormingsparameters omvatten de grootte van het gezichtsveld, de resolutie en de verblijftijd. Uitgaande van een doelresolutie van 10nm per pixel en 1 μs verblijftijd, duurt het fotograferen van een veld van 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm of 500 μm x500 μm 4 seconden, 100 seconden of 2.500 s om op te nemen. We kunnen deze beeldvormingstijden per sectie vermenigvuldigen met het aantal secties om de tijd te schatten die nodig is voor de volledige beeldvormingstaak. Lange beeldvormingstijden per sectie kunnen acceptabel zijn als het aantal secties klein is of als de tijd van het microscoopgereedschap geen probleem is.
Het is echter in de meeste gevallen noodzakelijk om de opnametijd te beperken tot een nachttaak of een weekendtaak. Een even kritisch aspect van 3D EM dat moet worden overwogen, is de hoeveelheid en structuur van de resulterende beeldgegevens. Het opnemen van de bovengenoemde beeldvelden in 100 secties genereert respectievelijk 400 mb, 10 gb of 250 GB aan beeldgegevens; de beelden van 500 μm x 500 μm vormen het bijkomende probleem dat ze elk groter zijn dan 2 gb. Veel van de softwareprogramma’s die worden gebruikt voor gegevensevaluatie kunnen geen afbeeldingen van deze grootte openen.
Om de beeldtijd te verkorten, is het belangrijk om pixelverblijftijd te kiezen om te voldoen aan de vereisten voor signaal-ruisverhouding voor de daaropvolgende gegevensevaluatie (bijv. Reconstructie, tracering) en de opnames te beperken tot gedefinieerde ROI’s. De AT-uitbreiding van de software vergemakkelijkt beeldacquisitie in kleine gebieden in seriële secties. De software ondersteunt handmatige en automatische workflows en vele semi-automatische varianten: beeldgebieden kunnen handmatig worden gepositioneerd en op elke sectie worden gericht, of de gebruiker kan de automatische sectiezoeker en positie-uitlijningsfuncties gebruiken. Afhankelijk van het automatiseringsniveau dat wordt gekozen en ondersteund door het voorbeeldtype of de beelddoelen, kan de tijd die nodig is voor het instellen van beeldacquisitie in honderden secties een hele werkdag (handmatig gedaan) of slechts enkele minuten duren. In principe maakt Array Tomography het uitdagender dan andere 3D EM-methoden om kleine ROI’s te verwerven; onnauwkeurige plaatsing van regio’s op opeenvolgende secties moet worden gecompenseerd door grotere gebieden te verwerven. Als de ROI bijvoorbeeld 20 μm x 20 μm groot is en de sectie-tot-sectie positievariabiliteit van beeldvormingsvelden 10μm is, moet men 40 μm x 40 μm afbeeldingen verkrijgen om er zeker van te zijn dat de ROI volledig wordt vastgelegd in elke afbeelding, op elke sectie. Real-world beeldpositievariabiliteit varieert van 100 μm tot <10 μm, afhankelijk van de beschikbaarheid of kwaliteit van softwarefuncties voor positie-uitlijning of het geduld van de gebruiker. Met deze software kan 10 μm worden bereikt zonder al te veel handmatige tussenkomst in de meeste monsters.
Zoals elke techniek heeft de AT verschillende zwakke punten die succesvolle gegevensverzameling kunnen beïnvloeden, en veel zijn vergelijkbaar met andere op secties gebaseerde methoden. Gebrek aan homogene verdeling van lege hars versus weefsel kan resulteren in gebogen of gebroken arrays. In extreme gevallen kunnen secties loskomen van de ondersteuning(figuur 6A). Variabele compressie of uitrekking tijdens het snijproces kan plooien creëren die het monster in variabele gebieden op volgende secties kunnen verstoren(figuur 6B). Mesmarkeringen kunnen op het oppervlak van de verzamelde secties verschijnen met behulp van een beschadigd mes(figuur 6C). Verschillen in sectiecondities kunnen incidentele sectiecompressie en dikteverschillen veroorzaken. Stof- of vuildeeltjes kunnen op een sectie terechtkomen en de interessezone gedeeltelijk verduisteren(figuur 6D). Beeldacquisitie kan mislukken als gevolg van onvolmaakte autocontrast, autofocus en auto-stigmatiseringsfuncties. De positionering van automatisch gemaakte beeldgebieden kan variabel zijn en kan de ROI in alle secties niet vastleggen.
Verschillende problemen kunnen zich voordoen in het stadium van stiksel en uitlijning. Het automatisch naaien van mozaïektegels kan bijvoorbeeld mislukken vanwege de grote lege ruimte in het monster. Door een drastische verandering in vorm in 3D kunnen beeldstapels een uitdaging zijn om te registreren. Speciaal ontwikkelde programma’s (bijv. IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB of MAPS-AT) kunnen semi-automatische uitlijning32,38,39,40 vergemakkelijken. Meer uitdagende secties kunnen handmatig worden uitgelijnd met behulp van fotobewerkingssoftware. Helaas zijn sommige datasets mogelijk niet correct uit te lijnen.
Grote monsters zijn een uitdaging voor TEM seriële secties die op roosters passen; aan de andere kant rechtvaardigen veel projecten geen lange automatische acquisitie met behulp van FIB/SEM of SBF-SEM. De AT is een eenvoudig alternatief voor een vervelende seriële sectie TEM waar het verzamelen en manipuleren van seriële secties op een wafer eenvoudiger is dan met de slotrasters. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om het verzamelen van de arrays te vergemakkelijken en we delen onze methode om de bestaande toolkit uit te breiden. In gevallen waar de identificatie van de ROI een uitdaging is, biedt AT-SEM een fundamenteel voordeel, met de efficiënte screening van de monsters waarbij organelschaalresolutie over 50 tot 500 secties vereist is. Voor grotere volumes kunnen de automatische AT-strategieën voor verzameling efficiënt worden verzameld als er meer secties nodig zijn. AT-monsters kunnen meerdere keren opnieuw worden afgebeeld, waardoor gebieden met een hoge resolutie op basis van eerder verkregen overzichtsbeelden doelgericht kunnen worden afgebeeld. Wij zijn van mening dat de gerichte analyse en verminderde oversampling door AT / SEM die hier wordt voorgesteld, de arbeids- en gegevensopslagvereisten vermindert. Uiteindelijk kunnen bibliotheken van secties worden verzameld en onderhouden voor later hergebruik en raadpleging. Voor volume-acquisitie bieden FIB- of SBF-SEM-benaderingen een uitstekende oplossing wanneer de ROI gemakkelijk te identificeren is op het blokvlak of als grote 3D-volumes nodig zijn voor de analyse. FIB/SBF-SEM zijn echter minder efficiënt wanneer de stackafbeelding met hoge resolutie op een gerichte manier moet worden verzameld uit een gedefinieerde ROI. Kortom, de voorgestelde methoden voor het screenen van AT-monsters en het gebruik van overzichtsbeelden met gemiddelde resolutie maken het mogelijk om beeldacquisitie te beperken tot de relevante delen van de sectie-array. Nauwkeurig richten van beeldregio’s versnelt de time-to-data en vereenvoudigt de gegevensevaluatie.
Kortom, hoewel het concept van AT/SEM niet nieuw is, is het gebruik ervan nog steeds niet zo wijdverspreid als de verdiensten ervan doen vermoeden. Over het algemeen biedt het een aanvullende procedure voor andere bestaande EM-methoden. AT/SEM is compatibel met het breedste scala aan monstervoorbereidingsprotocollen en beeldvormingsworkflows en kan als begeleidende techniek op elke FIB/SEM- of SBF-SEM-microscoop worden uitgevoerd. In dit artikel hebben we ons geconcentreerd op AT voor het vastleggen van ultrastructurele gegevens van monsters die minder snel met succes worden aangepakt door andere methoden. We hopen dat de beschreven procedure voor het gemakkelijk verzamelen van secties en aanzienlijk geautomatiseerde acquisitiestrategieën zal helpen bij de eerste pogingen voor degenen die de methode nog nooit zijn tegengekomen en zal helpen om het te perfectioneren voor degenen die al enige ervaring hebben.
The authors have nothing to disclose.
We willen de leden van de EM-faciliteit van de Universiteit van Lausanne bedanken voor hun steun tijdens deze ontwikkeling van verschillende stappen van de AT-procedure. We willen Gareth Griffiths, Marta Rodrigues, Urska Repnik, Christel Genoud, Helmut Gnaegi, Einat Zelinger, Paola Moreno-Roman, Lucy O’Brien en Lindsay Lewellyn bedanken voor de discussies tijdens de voorbereiding van het manuscript en kritisch lezen. We willen de groepen erkennen die de monsters hebben bijgedragen die zijn gebruikt om de verschillende scenario’s te demonstreren: Matthias Lutolf, Michail Nikolaev, Devanjali Dutta, Till Matzat en Fanny Langlet.
Cutting | |||
AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
Image acquisition | |||
FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
Image analysis | |||
Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |