Flusso di lavoro di tomografia ad array per l'acquisizione mirata di informazioni sul volume utilizzando la microscopia elettronica a scansione

Gli esempi riportati di seguito mirano a dimostrare la versatilità dei flussi di lavoro consigliati. Le illustrazioni del caso di studio sono progetti per i quali abbiamo avuto difficoltà ad ottenere risultati soddisfacenti con qualsiasi altra tecnica. Abbiamo scelto Drosophila adult per illustrare le sfide tipiche che si potrebbero incontrare con numerosi tipi di campioni. Questo organo tubolare di circa 6mm di lunghezza, 500-1000 μm in sezione trasversale, è diviso in diverse regioni con una funzione unica e composizione cellulare (Figura 4A)33. A seconda dell’orientamento del sezionamento, le dimensioni del profilo intestinale e il suo aspetto sulla sezione variano. Le sezioni orientate trasversalmente o longitudinalmente sono relativamente grandi e solo un paio possono essere posizionate su una singola griglia TEM (Figura 2F). Solo una piccola parte del tessuto può essere ripresa nel FIB e per l’SBF-SEM, la difficoltà è simile a qualsiasi campione non omogeneo. AT fornisce un compromesso efficiente per l’analisi di tali campioni e l’incorporamento piatto facilita la localizzazione del ROI. Un’attenta rifilatura dell’eccesso di resina intorno all’area selezionata (Figura 4B) è importante per una raccolta efficiente degli array dall’area pertinente (Figura 4C). Centinaia di sezioni possono essere raccolte su un singolo wafer in sequenza o casualmente (Figura 4D). A seconda della domanda di ricerca, lo screening e l’acquisizione del campione richiederanno una strategia diversa, che abbiamo arbitrariamente diviso in diversi scenari. Per illustrare diversi scenari presentati in modo più mirato, abbiamo scelto diversi casi di studio dal diverso progetto di ricerca. Analisi di numerose strutture di grandi dimensioni distribuite casualmente nell’intervallo 1-10 μm (Figura 4E)Spesso, sono necessari dati ultrastrutturali per convalidare un’ipotesi nata da diversi approcci sperimentali, confrontando una condizione standard e sperimentalmente alterata. In questi casi, diverse sezioni vengono in genere raccolte casualmente su griglie e schermate per localizzare e visualizzare le aree di interesse. Questa tattica è di solito meno sistematica e limitata a un piccolo numero di sezioni analizzate. Suggeriamo di registrare panoramiche di decine / centinaia di sezioni a media risoluzione da un determinato nastro (Figura 4D). Per sezioni tipiche di 70 nm, 200 sezioni si estenderanno su circa 14 μm, che conterranno numerose celle, interamente o parzialmente, completate entro mezz’ora. Come primo passo, viene registrata la panoramica a bassa risoluzione dell’intero nastro e la panoramica aiuta a omettere le sezioni che mostrano artefatti di preparazione (ad esempio, pieghe, sporco). Successivamente, l’acquisizione può essere eseguita manualmente o automaticamente direttamente su parti selezionate della sezione, o su un’intera sezione, utilizzando l’imaging singolo o a mosaico, seguito da cuciture (Figura 4E). Successivamente, le immagini dell’area selezionata possono essere acquisite utilizzando parametri ad alta risoluzione. Ad esempio, mitocondri, nuclei e microvilli possono beneficiare di un tale metodo statisticamente migliorato (Figura 4Ei-iii). Analisi di più strutture piccole e scarsamente distribuite nell’intervallo 500-1.000 nm (Filmato supplementare 1)In questo scenario, il ROI non può essere semplicemente identificato in una scansione panoramica a basso ingrandimento e sono necessarie immagini ad alta risoluzione. Nei campioni TEM convenzionali, il noioso zoom avanti e indietro della sezione è necessario fino a quando non viene trovata la funzionalità richiesta. Spesso, l’imaging di diverse posizioni indipendenti in più campioni è statisticamente più rilevante rispetto alla generazione di un singolo grande volume. In questi casi, la complessità dell’acquisizione manuale cresce esponenzialmente. Sebbene diverse soluzioni TEM consentano l’acquisizione automatica o lo screening di più griglie, le dimensioni della griglia e le sfide di sezionamento seriale spesso rendono l’approccio incompatibile per molti campioni. Per casi simili, generiamo una mappa completa a media risoluzione di un ROI complessivo in più sezioni a una risoluzione sufficiente a identificare le strutture di interesse. Durante questa fase di screening laterale, è consigliabile saltare più sezioni alla volta, con l’obiettivo di colpire almeno una parte della struttura di interesse quando viene affrontata in modo casuale. Ciò dipenderà in gran parte dalle dimensioni generali della struttura: ad esempio, se la dimensione complessiva della struttura è di 500 nm e le sezioni hanno uno spessore di 50 nm, almeno nove sezioni sequenziali di fila conterranno probabilmente una parte della struttura di interesse. In questo modo, il salto di 6-7 sezioni deve essere efficiente per trovare molti tipi diversi di strutture in più aree. L’acquisizione automatica delle mappe a mosaico risolte delle sezioni selezionate consente un attento screening di queste sezioni dopo la loro acquisizione. Una volta acquisita una mappa ad alta risoluzione, è possibile ritagliare diversi ROI o utilizzarli per definire ulteriori aree di imaging locale sui ROI (Filmato supplementare 1). Golgi, centrioli, giunzioni, microtubuli, diversi tipi di vescicole sono buoni esempi delle strutture che potrebbero beneficiare di questo scenario (Filmato supplementare 1). Analisi di GRANDI ROI scarsamente distribuiti in campioni di grandi dimensioni (Figure 4F-4H)Questo scenario comporta eventi rari, che sono spesso descritti come “un ago in un pagliaio” in cui il problema non è nell’identificazione del ROI ma nella sua localizzazione. Per molti campioni l’approccio correlativo non è un’opzione valida, ma spesso il ROI ha un’ultrastruttura rivelatrice e, se localizzato, può essere identificato con elevata affidabilità. Per questi campioni, è essenziale applicare l’acquisizione multilivello, a partire dai campioni pre-selezionati con decine o centinaia di sezioni a media risoluzione. Nel software utilizzato qui, ci sono due diverse strategie per ottenere set di immagini di più sezioni: Registrazione delle immagini di anteprima a una risoluzione più elevata o acquisizione di un Set di tile array con impostazioni appropriate (Figura 4F). Diversi tipi di cellule specializzatenell’intestino di Drosophila sono distribuiti in modo casuale (ad esempio cellule staminali, enteroendocrine) e sottili sezionati a orientamento casuale. Eppure possono essere visivamente distinti dopo aver esaminato le immagini ottenute utilizzando parametri ad alta risoluzione sia da singole sezioni che come raccolta di immagini seriali (Figura 4G). Dopo l’allineamento, gli stack possono essere renderizzati utilizzando diverse soluzioni software(Figura 4H,Filmato supplementare 2). Scenario 1: organoidi intestinali (Figura 5A)Gli organoidi stanno rapidamente diventando uno degli strumenti più all’avanguardia delle moderne scienze della vita. Questo modello di organo derivato da cellule staminali 3D quasi fisiologico rende possibile uno studio accurato di una serie di processi biologici in vivo, tra cui il rinnovamento dei tessuti, la risposta ai farmaci e la medicina rigenerativa. I mini-tubi intestinali34 introdotti di recente aprono una nuova generazione di tecnologia organoide, molto simile alla fisiologia dei tessuti in vivo, alla composizione del tipo cellulare e all’omeostasi, consentendo ampie prospettive per la modellazione della malattia, l’interazione ospite-microbo e la scoperta di farmaci. Tuttavia, quando è richiesta la caratterizzazione ultrastrutturale, la localizzazione di diversi tipi di cellule in tessuti così grandi utilizzando campioni casuali può essere difficile. Inoltre, nei test di “infezione” variabili, è fondamentale assicurarsi che l’analisi riveli diversi stadi di sviluppo che influenzano il tessuto. Per tali studi, la copertura statisticamente significativa del campione è centrale, ma difficile da ottenere utilizzando il tradizionale approccio TEM on-grid. AT-scenario 1 è utile in questi casi: molte sezioni sequenziali possono essere generate su un wafer (Figura 5Aii) e schermate utilizzando parametri a bassa risoluzione per localizzare le aree generali di interesse (Figura 5Aiii; frecce). Queste aree possono essere mirate per ulteriori analisi utilizzando parametri di acquisizione avanzati (Figure 5Aiv e Figura 5Av). Quando viene rilevata una struttura rilevante (in genere un cluster di 5-10 sezioni una volta ogni 100-300 sezioni), è facile concentrarsi su ciascuna delle strutture di interesse e acquisire manualmente singole immagini o utilizzare le funzionalità di automazione per acquisire volumi di immagini su più sezioni. Scenario 2: Drosophila pupal notum ( Figura5B)Studiare la divisione cellulare e i meccanismi che controllano la progressione attraverso il ciclo cellulare è fondamentale per comprendere sia i processi standard che quelli alterati negli organismi multicellulari. Le informazioni esistenti sono spesso derivate da sistemi unicellulari; tuttavia, questa soluzione manca del contesto critico delle interazioni 3D tra le cellule di un tessuto. Un monostrato monocellulare del notum, il dorso in via di sviluppo della larva di Drosophila, è un modello perfetto per l’interazione tra le cellule epiteliali in generale e la divisione cellulare in particolare35. È un modello consolidato per studi di interazioni molecolari e cellulari che utilizzano la combinazione dei dati disponibili mediante microscopia fluorescente e manipolazioni genetiche. L’ascissione, l’ultimo passo della divisione cellulare, assicura la separazione finale tra due cellule che si dividono e caratterizzare i cambiamenti strutturali che si verificano durante l’abscissione è essenziale per la nostra comprensione della mitosi. Tuttavia, le divisioni mitotiche nel notum non sono facili da localizzare a livello ultrastrutturale: le cellule sono relativamente grandi, rispetto alla zona di abscissione (Figura 5B). Il rapporto tra la dimensione complessiva della zona di abscissione e la superficie della sezione da coprire è ampio (Figura 5Bi). Anche se è possibile localizzare la zona di abscissione utilizzando i metodi TEM o SBF-SEM36, il compito è laborioso. Con questo scenario, le immagini di panoramica automatica a media risoluzione dei salti di 20-40 sezioni possono essere utilizzate per localizzare le celle in divisione (Figura 5Bii). Quando tali celle vengono identificate, le sezioni fungono da ancoraggio per un esame più attento delle sezioni nelle vicinanze e numerose celle divisorie possono essere trovate e selezionate per ulteriori analisi. In questo modo, la zona di abscissione può essere localizzata e fotografata nella sua interezza (Figura 5Biii). A seconda della domanda, è possibile raccogliere singole immagini ad alta risoluzione o 3-7 sequenze di immagini per coprire la profondità della struttura (Figura 5Biv). Scenario 3: neuroni taniciti di topo (Figura 5C)Il topo fornisce un modello ben consolidato per lo sviluppo del cervello ed è ben documentato su diversi livelli, anche da EM. Anche se diversi metodi automatizzati seriali-block-face sono stati ampiamente utilizzati per studiare il tessuto cerebrale, ci sono casi in cui AT è più adatto a raccogliere i dati necessari. L’ipotalamo è un modello di neuroscienza ben consolidato, una parte del cervello che contiene più funzioni di tipo neuronale. I taniciti ipotalamici rappresentano un particolare sottoinsieme di cellule ependimogliali che rivestono il fondo del terzo ventricolo, con processi insolitamente lunghi (fino a 300 μm) e grandi piedini terminali (~5 μm)37. Questo li rende scomodi per l’analisi con metodi TEM o FIB. Il compito è ulteriormente complicato quando diversi taniciti indipendenti devono essere localizzati e analizzati. Uno degli approcci per facilitare questo compito può essere il targeting semi-correlativo, in cui la mappa di fluorescenza è ottenuta dai campioni etichettati fluorescentemente prima del fissaggio e dell’incorporamento per EM. Il sezionamento viene eseguito sull’area catturata combinando le informazioni posizionali del campione di fluorescenza e la replica in plastica piatta incorporata. Successivamente, è possibile utilizzare lo scenario AT 3: vengono generate le immagini a mosaico panoramiche di alto livello per rivelare le regioni con cluster di piedi terminali di tanycyte. Successivamente, le funzionalità di automazione nel software vengono utilizzate per impostare l’acquisizione di sequenze delle immagini da una o più aree in una singola immagine o in modalità piastrellata. Queste immagini possono essere analizzate separatamente, come pile allineate o renderizzate successivamente. La potenza del metodo AT consente l'”aggiornamento” relativamente semplice dei dati da 2D a 3D: le mappe sono disponibili dall’acquisizione primaria e i volumi possono essere ottenuti dall’area selezionata e dalle sue vicinanze. Lo stack risultante può essere allineato e successivamente sottoposto a rendering. È essenziale determinare in anticipo quale risoluzione e qualità dell’immagine sono necessarie per trovare i ROI. L’imaging dovrebbe consentire di riconoscere i ROI, ma non oltre questo valore perché il tempo di acquisizione scala proporzionalmente al tempo di permanenza dei pixel e al quadrato inverso della dimensione dei pixel. Figura 1: Sfide della preparazione del campione EM e dell’acquisizione del volume. (A) La perdita di fluorescenza e il restringimento si verificano a causa di un’elevata concentrazione di metalli pesanti e della disidratazione durante la preparazione del campione. i) Un disegno schematico di un campione osservato sotto LM (ii) lo stesso campione preparato per EM, che diventa completamente opaco e perde circa il 10% del suo volume. (B) L’incorporamento del campione viene in genere effettuato utilizzando resine epossidiche o acriliche. I blocchi tradizionali (i) possono essere utilizzati con successo per campioni omogenei che non richiedono un particolare orientamento. I blocchi piatti (ii) sono utili quando è essenziale mirare e orientare al microscopio, un’area precisa finalizzata al sezionamento, ad esempio in campioni non omogenei o procedure di microscopia correlativa. (C) Dell’intero volume del campione, solo una frazione limitata è rappresentata su una singola sezione di 50 nm, fornendo un’immagine 2D di un campione 3D, spesso in un orientamento sconosciuto. (D) Per illustrare il problema della registrazione di volumi eccessivamente grandi rispetto al targeting preciso, abbiamo scelto tre cubi concentrici con le facce di 1000, 500 e 50 μm organizzati per includere un ipotetico campione di 1000 x 500 x 500 μm (marrone scuro). Se tali ipotetici cubi campione sono accuratamente sezionati con fette da 50 nm, per coprire l’intero volume, saranno necessari un totale di 20.000, 10.000 e 1.000 fette e 800 tb, 100 tb e 100 gb, di conseguenza (risoluzione di imaging 5 nm x 5 nm x 50 nm, dati a 8 bit). Ciò dimostra l’importanza di pianificare l’acquisizione dei dati EM solo per acquisire il volume minimo necessario. (E) Coprire un’ampia superficie del campione in alta risoluzione presenta un problema simile a quello di un grande volume. Il affiancamento di diverse immagini ad alta risoluzione in una sola è una soluzione utile per un tale problema. Tuttavia, per coprire una superficie di 1 mm x 1 mm utilizzando il telaio 2024 x 1048 con ingrandimento 10.000x sarà necessario un vasto numero di piastrelle, che possono diventare difficili da cucire. Inoltre, se le sezioni sono compresse o distorte in modo variabile durante il taglio, le pile di dati risultanti diventano quasi impossibili da allineare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Il flusso di lavoro per la generazione diretta delle matrici di sezioni su supporto di grandi dimensioni. (A) Per il taglio stretto utilizzando lo strumento di taglio, i blocchi sono fissati all’interno del supporto microtome. Questo passaggio aiuta a garantire i lati paralleli di un blocco e riduce anche la resina vuota attorno al campione. (B) Un coltello modificato per le acquisizioni di sezioni AT. Una barca di grandi dimensioni facilita il trasferimento delle sezioni e la loro manipolazione durante il sezionamento del campione e il trasferimento sul supporto. Un grande bacino consente la manipolazione delle sezioni; il sistema di drenaggio limita il movimento dei nastri durante la fase di drenaggio, il fondo piatto rende affidabile l’asciugatura graduale del supporto. (C) Il coltello, pronto per il sezionamento con un wafer scaricato a bagliore posto sul fondo della bacinella e acqua livellata ai bordi. La costruzione del coltello mantiene l’ago incorporato, senza interferire con il supporto. (D) Generazione di array, vista dall’alto sull’area di sezionamento del microtomo. (i) Le prime sezioni sono di solito facili da ottenere in quanto si attaccano l’una all’altra e formano un nastro regolare. (ii) Quando più sezioni vengono aggiunte al nastro e diventa più lungo, il nastro perde la sua stabilità e spesso si curva. È fondamentale mantenere le tracce della sequenza organizzate in sequenza in preparazione per la fase di acquisizione dell’immagine. (iii) Quando un nastro di sezioni raggiunge la lunghezza desiderata, viene accuratamente staccato dal bordo del coltello usando una ciglia. iv) l’acqua viene drenata dal bacino; il wafer rimane all’interno fino a quando non è completamente asciutto all’aria. Questo passaggio è essenziale, in quanto aiuta a raddrizzare le sezioni ed evitare la formazione delle micro pieghe. Il wafer viene posto in forno a 60°C per almeno 30 min per fissare le sezioni sul supporto. (E) Esempi di wafer con le sezioni trasferite. Sebbene sia conveniente ottenere nastri dritti e precisi, i campioni reali impediscono la formazione di nastri ideali nella maggior parte dei casi. Tuttavia, anche i nastri “sciatti” sono molto istruttivi per il vasto numero di casi e l’importanza del nastro “pulito” dipenderà da una strategia di ricerca per la quale vengono raccolte le sezioni. Scala a barre 1 cm. (F) Esempio di griglie di slot con le sezioni seriali. Anche quando molte sezioni sono raccolte su una griglia, è ancora una piccola frazione di ciò che può essere raccolto su un singolo wafer. L’abilità richiesta per padroneggiare il trasferimento delle sezioni su una griglia (in particolare la griglia a fessura) ha rappresentato un collo di bottiglia significativo per la padronanza della preparazione del campione al microscopio elettronico. Scala bar 500 μm. (G) Indipendentemente dal metodo di raccolta delle sezioni utilizzato, i punti di forza dell’approccio AT sono la relativa facilità di generazione di sezioni sequenziali, rispetto alla raccolta on-grid. Se si considera un blocco campione di 1000 μm x 500 μm, non vi è alcun problema a montare circa 100 sezioni su un wafer di 2 cm x 4 cm (i). Le sezioni della stessa dimensione su una griglia di slot si adattano solo a tre sezioni/griglia al massimo (ii). Forniamo un’immagine in scala per mostrare quante griglie potrebbero essere necessarie per coprire lo stesso numero di sezioni, senza menzionare la difficoltà di raccogliere sezioni seriali sulla griglia. Barra della scala = 1 cm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Passaggi critici del flusso di lavoro della tomografia array. Schema del flusso di lavoro per l’acquisizione automatica di stack di immagini ad alta risoluzione. Tutti i passaggi preparatori sono automatizzati (simboli di ingranaggi verdi) e non richiedono alcuna azione da eseguire manualmente, sezione per sezione. Le pile di immagini possono essere allineate in qualsiasi software di analisi delle immagini in grado di allineare automaticamente rigidi o affini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Tre scenari di acquisizione con Drosophila adult gut come modello dimostrativo. (A) disegno di una Drosophila midgut sezionata, con tre regioni principali designate da diversi colori: anteriore, centrale e posteriore. (B) Blocco piatto rifilato in cui un budello è orientato per il sezionamento trasversale. Si noti che la quantità di resina vuota è attentamente bilanciata attorno al tessuto contenente la regione di interesse (rettangolo bianco). (C) Le sezioni seriali trasversali galleggiano sulla superficie dell’acqua all’interno del bacino del coltello AT. Tutte le immagini sono state acquisite in modalità SEM elettronica secondaria utilizzando il rilevatore a specchio con il contrasto inverso. (D) Immagine a mosaico cucita di sezioni seriali trasversali su un wafer. La barra della scala è di 1000 μm. (E) Sezione trasversale attraverso l’intestino di Drosophila. Scala bar 20 μm. L’immagine è un mosaico cucito di 7 x 7 immagini di fascia media. Inserti – immagini a ingrandimento e risoluzione più elevate delle regioni specifiche di interesse: (ii) nucleo, (iii) bordo del pennello e (i) mitocondri. Scala bar 5 μm per tutti. (F) Un’immagine a medio raggio di una sezione trasversale attraverso l’intestino che prende di mira la posizione delle cellule in via di sviluppo (quadrato). La barra di scala è di 20 μm. (G) L’array mirato di sezioni seriali raccolte in base all’area localizzata durante l’analisi della sezione presente nel pannello F. La barra della scala è di 10 μm. (H) Il modello 3D viene renderizzato in base alla sequenza di stack di 50 sezioni ottenuta dall’acquisizione seriale mirata nel pannello G. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Casi di studio per gli scenari di applicazione dell’AT. (A) Localizzazione di diverse strutture cellulari nell’organoide intestinale. (i) Microchip di silicio incorporato. Barra della scala = 200 μm. (ii) Un’immagine a mosaico cucita di 127 sezioni trasversali attraverso la parte centrale del chip. Barra di scala = 1500 μm (iii) Quattro immagini a bassa risoluzione di una sezione trasversale completa attraverso la porzione dell’organoide intestinale. Le frecce indicano il potenziale sito di interesse. La barra di scala è di 20 μm. (iv) Diversi ROI, mirati su micrografie a bassa risoluzione selezionate per ulteriori analisi. Barra di scala = 10 μm. (v) Immagine ad alta risoluzione della cellula infetta di interesse. L’analisi della stessa regione nelle sezioni adiacenti può fornire informazioni 3D mirate, se necessario. Scala bar = 5 μm. (B) Localizzazione midbody in Drosophila melanogaster pupal notum. (i) Una visione schematica di una pupa di Drosophila sezionata. Notum esposto per la dissezione (beige) dopo aver rimosso la parte della cuticola protettiva (marrone). La linea nera indica la direzione di sezionamento (ii) Una sezione trasversale attraverso l’area presentata nel diagramma. L’immagine combina immagini SEM ad alta risoluzione scattate in sequenza 3×7 cucite su un pannello a mosaico. Il rettangolo nero delimita l’area che contiene una cella in divisione. La barra della scala è di 15 μm. (iii) Un’immagine ingrandita sulla cella divisoria dal pannello ii. A questo ingrandimento e risoluzione, il midbody è evidente (frecce bianche). L’intera sezione viene analizzata per trovare le celle in divisione. Saltare tra diversi nastri di sezioni in intervalli di 20-30 sezioni durante la fase di screening laterale consente di localizzare numerose coppie di cellule divisorie. La barra della scala è di 5 μm (iv) quando una cella divisoria è localizzata, immagini sequenziali del midbody raccolte da quattro sezioni intorno al midbody delimitate da un quadrato giallo nel pannello (iii). La barra della scala è 1 μm. (C) Localizzazione dei piedi terminali dei tanyciti nell’ipotalamo di topo. (i) Immagine di fluorescenza di una fetta di vibratoma. I tanycytes esprimono la proteina fluorescente tdTomato (rossa). Un rettangolo bianco delimita l’area di interesse. Scala bar 500 μm. (ii) La stessa sezione di vibratoma preparata per EM sarà accuratamente tagliata intorno all’area di interesse, in base alla correlazione indiretta delle informazioni fluorescenti dal pannello (i). La linea bianca tratteggiata rappresenta l’area di sezionamento ultrasottile. La barra della scala è di 50 μm per entrambi i pannelli. (iii) Sezione trasversale attraverso la fetta di vibratome nell’area di interesse. L’immagine del mosaico SEM è composta da 75 immagini cucite. Diverse sezioni sono prese di mira dallo screening laterale e fotografate con parametri simili. Le sezioni vengono analizzate “offline” per trovare il ROI – l’endfeet dei tanycyte. Il rettangolo nero rappresenta l’area che contiene le estremità dei tanycyte. Questa sezione servirà da ancoraggio per ulteriori analisi. La barra della scala è di 15 μm. (iv) Immagine ad alta risoluzione e ad alto ingrandimento degli occhi dei tanycyte che circondano un vaso sanguigno. Dopo la localizzazione iniziale del ROI su una sezione, la sequenza z viene raccolta dalle sezioni adiacenti a monte della sezione di ancoraggio (pannello iii). Barra della scala 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: I problemi durante l’ultra-microtomia, la raccolta delle sezioni e lo stoccaggio delle sezioni possono portare a artefatti. (A) Sezioni di campioni di cervello su un wafer. La maggior parte della resina vuota si staccò dal tessuto e si ripiegò su se stessa (seppia). La casella nera tratteggiata indica un’area utilizzata per contenere l’intera sezione. Scala bar 500 μm. (B) Una piccola piega locale sulla superficie di una sezione di zebrafish spessa 50 nm. Scala barra 1 μm. (C) Segno di coltello sulla superficie di una sezione cerebrale di topo a 70 nm. Scala barra 5 μm. (D) I capelli (asterisco) sulla superficie del wafer che copre parzialmente una sezione muscolare di zebrafish. In giallo, il tessuto è mirato per l’analisi. In rosa, una cella utilizzata come riferimento per le dimensioni dell’area interessata. Scala barra 50 μm. (E) Zebrafish notochord con rughe in basso a destra (frecce nere), dove il tessuto neurale denso (ombreggiato in blu) confina con tessuto muscolare più morbido e resina vuota (frecce nere). Scala bar 10 μm. (F) Segmentazione del volume di una pila di 50 immagini come in E, mostrando che questa regione ha mostrato rughe nella maggior parte delle sezioni. Il poligono tratteggiato delinea l’area mostrata nella barra della scala G. 10 μm. (G) XY vista della stessa segmentazione del volume come in F, mostrando le rughe come brevi tratti neri nella metà destra del blocco. Si noti che l’allineamento della pila nelle parti rimanenti del tessuto non è influenzato dalle rughe. Scala barra 5 μm. (H) Proiezione XZ della stessa area di G, che mostra le rughe in tutte le 50 sezioni. Barra della scala 5 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Filmato supplementare 1: Un’immagine di montaggio ad alta risoluzione di una sezione trasversale attraverso il midgut anteriore di Drosophila. Immagine a mosaico di un’immagine SEM SE-MD invertita. 352 tessere immagine separate sono state acquisite automaticamente a 5 nm di risoluzione e cucite per presentare l’intera sezione trasversale. È possibile ingrandire per maggiori dettagli e ottenere una copertura esaustiva dei dati, utilizzando la stessa immagine. Giunzioni strette, microtubuli, diversi tipi di vescicole possono essere quando si ingrandisce. La barra della scala è di 10 μm. Fare clic qui per scaricare questo filmato. Filmato supplementare 2: Rendering delle cellule intestinali di Drosophila. Cinquanta immagini a mosaico allineate delle sezioni nell’area di divisione delle cellule intestinali. Rendering IMOD dei bordi cellulari (blu, turchese e arancione) e dei nuclei (bianco). Clicca qui per scaricare questo film. Materiali supplementari. Fare clic qui per scaricare questo file.