走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

以下の例は、推奨されるワークフローの多様性を示すことを目的としています。ケーススタディのイラストは、他のテクニックで満足のいく結果を得るのが難しかったプロジェクトです。私たちは、多くのタイプのサンプルで遭遇する可能性のある典型的な課題を説明するために、ショウジョウバエの成人を選びました。この管状器官は、長さ約6mm、断面で500〜1000μm、独特の機能と細胞組成を有する異なる領域に分けられる(図4A)33。断面の向きによって、腸のプロファイルの寸法とセクションの外観が異なります。横断的または縦方向の方位のセクションは比較的大きく、単一のTEMグリッドに配置できるのはカップルだけです(図2F)。組織のごく一部のみをFIBで画像化することができ、SBF-SEMの場合、難易度は非均質なサンプルと同様である。ATは、このようなサンプルの分析のための効率的なトレードオフを提供し、フラット埋め込みはROIのローカリゼーションを容易にします。選択した領域の周囲の樹脂の過剰を慎重にトリミングする(図4B)は、関連する領域からアレイを効率的に収集するために重要である(図4C)。1つのウェーハ上で、連続またはランダムに何百ものセクションを収集できます(図4D)。研究の質問に応じて、サンプルスクリーニングと取得には異なる戦略が必要であり、我々は任意に複数のシナリオに分けられます。さまざまなシナリオをよりターゲットにした方法で説明するために、異なる研究プロジェクトからいくつかのケーススタディを選択しました。 ランダムに分布する多数の大構造物の解析 1~10 μm範囲 (図4E)多くの場合、超構造データは、いくつかの実験的アプローチから生じた仮説を検証するために必要であり、標準と実験的に変化した状態を比較する。このような場合、一般的にグリッド上でランダムに収集され、対象領域をローカライズして画像化するために、いくつかのセクションがスクリーニングされます。この戦術は通常、あまり体系的ではなく、分析されたセクションの数に限定されます。特定のリボンから数十/数百の中解像度セクションの概要を記録することをお勧めします (図 4D)。70 nmの典型的なセクションでは、200個のセクションが約14 μmに及び、30分以内に完了した多数の細胞(完全または部分的に)が含まれます。最初のステップとして、リボン全体の低解像度の概要が記録され、概要は、準備アーティファクト(例えば、折り目、汚れ)を示すセクションを省略するのに役立ちます。取得後、手動または自動で、セクションの選択した部分に直接、またはセクション全体に対して、単一またはモザイクイメージングを使用して、ステッチング(図4E)を行うことができます(図4E)。後で、選択した領域からの画像を高解像度のパラメータを使用して取得できます。例えば、ミトコンドリア、核、およびマイクロビリは、このような統計的に改善された方法の恩恵を受けることができる(図4Ei-iii)。 複数の小さく、まばらな分布構造の分析 500-1,000 nm 範囲 (補足動画 1)このシナリオでは、低倍率の概要スキャンでは ROI を識別できず、高解像度のイメージが必要になります。従来の TEM サンプルでは、必要な機能が見つかるまで、セクションのズームインとズームアウトが必要です。多くの場合、複数のサンプル内の複数の独立した場所をイメージングすることは、単一の大きなボリュームの生成よりも統計的に関連性が高くなります。このような場合、手動取得の複雑さは指数関数的に増加します。複数の TEM ソリューションを使用すると、自動取得や複数のグリッドのスクリーニングが可能になりますが、グリッドのサイズとシリアル断面化の課題によって、多くのサンプルに対してこのアプローチに互換性が持たれない場合が頻繁に発生します。同様のケースでは、対象の構造を特定するのに十分な解像度で、複数のセクションで全体的なROIの完全な中解像度マップを生成します。この横スクリーニングステップでは、ランダムに接近したときに関心のある構造の少なくとも一部を打つことを目指して、一度に複数のセクションを飛躍させることをお勧めします。これは構造の全体的な寸法に大きく依存します:例えば、構造の全体的なサイズが500nmで、セクションが50nm厚い場合、行内の少なくとも9つの連続したセクションが対象の構造の一部を含む可能性が高い。このようにして、6-7セクションのスキップは、複数の領域で多くの異なる種類の構造を見つけるのに効率的である必要があります。選択したセクションの解決されたモザイク マップを自動取得すると、これらのセクションを取得後に慎重にスクリーニングできます。このような高解像度マップを取得すると、いくつかの ROI を切り取るか、または ROI (補足ムービー 1)上の追加のローカル イメージング領域を定義するために使用できます。ゴルジ、セントリオレス、接合部、微小管、異なるタイプの小胞は、このシナリオの恩恵を受ける可能性のある構造の良い例である(補足ムービー1)。 大サンプル中のまばら分布の大きいROIの分析(図4F-4H)このシナリオでは、問題がROI識別ではなくローカリゼーションにある「干し草の山の針」とよく言われる、まれなイベントが含まれます。多くのサンプルの相関アプローチは有効なオプションではありませんが、多くの場合ROIは明らかな超構造を有し、ローカライズされると高い信頼性で識別できます。これらのサンプルでは、中解像度で数十から数百のセクションを含む事前にスクリーニングされたサンプルから始めて、マルチレベル取得を適用することが不可欠です。ここで使用するソフトウェアでは、複数のセクションのイメージ セットを取得するための 2 つの異なる方法があります: プレビュー イメージを高解像度で記録する、または適切な設定で配列タイル セットを取得する (図 4F)。ショウジョウバエ 腸内の異なる特殊な細胞タイプは、ランダムに分布し(例えば、ステム、腸内分泌細胞)、およびランダムな配向で薄いセクション。しかし、これらは、単一のセクションから、またはシリアル画像の集合として、高解像度のパラメータを使用して得られた画像をスクリーニングした後に視覚的に区別することができます(図4G)。アライメントの後、スタックはさまざまなソフトウェア ソリューション (図 4H、補足ムービー 2) を使用してレンダリングできます。 シナリオ1:腸オルガノイド(図5A)オルガノイドは、現代の生命科学の最先端のツールの1つになりつつあります。この生理学的な3D幹細胞由来の器官モデルはティッシュの再生、薬剤への応答および再生医学を含む生体内の生物プロセスの範囲の正確な研究を可能にする。最近導入されたミニ腸管34は、生体内組織生理学、細胞型組成、ホメオスタシスに密接に似た新世代のオルガノイド技術を開き、疾患モデリング、宿主微生物相互作用、および創薬に対する広い視点を可能にする。しかし、超構造特性化が必要な場合、ランダムサンプルを用いた大きな組織などで異なる細胞型の局在化が困難になる場合がある。また、可変的な「感染」アッセイでは、分析が組織に影響を与える異なる発達段階を明らかにすることが重要です。このような研究では、サンプルの統計的に有意なカバレッジが中心でありながら、従来のTEMオングリッドアプローチを使用して達成することは困難です。ATシナリオ1は、このような場合に有益である:多くのシーケンシャルセクションは、ウエハー(図5Aii)上に生成され、関心のある一般的な領域を局所化するために低解像度のパラメータを使用してスクリーニングすることができます(図5Aiii;矢印)。これらの領域は、高度な取得パラメータ(図5Aiv および 図5Av)を使用して、さらなる分析を対象とすることができます。関連する構造(通常は100~300セクションに1回ずつ5~10セクションのクラスター)が検出されると、対象の各構造に集中して、単一の画像を手動で取得したり、オートメーション機能を使用して複数のセクションにわたって画像ボリュームを取得することができます。 シナリオ2:ショウジョウバエプパル・ノータム(図5B)細胞分裂と細胞周期を通して進行を制御するメカニズムを研究することは、多細胞生物の標準的なプロセスと変化したプロセスの両方を理解するために重要です。存在する情報は、多くの場合、単細胞系から導き出されます。しかし、この溶液は、組織内の細胞間の3D相互作用の重要な文脈を欠いている。単一細胞単層である公別体の、ショウジョウバの幼虫の発達後部は、特に35の細胞分裂と一般における上皮細胞との相互作用に最適なモデルである。これは、蛍光顕微鏡と遺伝子操作によって利用可能なデータの組み合わせを使用して、分子および細胞相互作用研究のための確立されたモデルです。細胞分裂の最後のステップである棄権は、2つの分裂細胞間の最終的な分離を保証し、棄権の間に起こる構造変化を特徴付けることは、有糸分裂の理解に不可欠である。しかし、柱の有糸分裂は、超構造レベルでの局所化が容易ではない:細胞は、棄権帯と比較して比較的大きい(図5B)。被覆する断面の全体の大きさと断面の表面との比率は大きい(図5Bi)。TEMまたはSBF-SEM法36を用いて棄権ゾーンを局地化することは可能ですが、この作業は面倒です。このシナリオでは、20 ~ 40 セクションの飛躍の自動中解像度の概要イメージを使用して、分割セルをローカライズできます (図 5Bii)。このような細胞が同定されると、セクションは近くのセクションを詳しく調べるためのアンカーとなり、さらに分析するために多数の分裂細胞を見つけて選択することができます。このようにして、アブシスゾーン全体を見つけて画像化することができます(図5Biii)。質問に応じて、単一の高解像度画像または3〜7の画像シーケンスを収集して、構造の深さをカバーすることができます(図5Biv)。 シナリオ3:マウスタニルテニューロン(図5C)マウスは脳の発達のための確立されたモデルを提供し、EMによって含む異なるレベルで十分に文書化されています。脳組織を研究するためにさまざまな自動連続ブロック顔法が広く使用されているにもかかわらず、ATが必要なデータを収集するためにより良く適応されている場合があります。視床下部は、十分に確立された神経科学モデルであり、複数の神経細胞タイプの機能を含む脳の一部である。視床下部のタニュサイトは、第3心室の底部に並ぶエペンディモグリア細胞の特定のサブセットを表し、異常に長いプロセス(最大300μm)および大きなエンドフィート(〜5μm)37を有する。これにより、TEMまたはFIB法による分析には不便です。いくつかの独立したタニサイトをローカライズして分析する必要がある場合、タスクはさらに複雑になります。この作業を容易にするアプローチの1つは、EMの固定および埋め込み前に蛍光標識サンプルから蛍光マップを得るセミコリ相関ターゲティングであり得る。断面は、蛍光サンプルと平らな埋め込みプラスチックレプリカからの位置情報を組み合わせることによって捕捉された領域に対して行われる。その後、ATシナリオ3を使用することができます:高レベルの概観図画像が生成され、タニサイトエンドフィートクラスターを持つ領域が明らかになります。その後、ソフトウェアのオートメーション機能を使用して、1つまたは複数の領域から画像のシーケンスの取得を単一の画像またはタイルモードで設定します。これらの画像は、個別に、整列されたスタックとして分析するか、その後にレンダリングすることができます。 AT法の力により、2Dから3Dへのデータの比較的簡単な「アップグレード」が可能になります:マップは一次取得から利用可能であり、ボリュームは選択された領域とその周辺から得ることができます。結果のスタックは、整列し、その後レンダリングできます。ROI を見つけるために必要な解像度と画質を事前に判断することが重要です。取得時間はピクセルドウェル時間とピクセルサイズの逆二乗に比例して比例するため、イメージングではROIを認識できますが、この値を超えては認識できません。 図1:EMサンプル調製と体積獲得の課題( A)サンプル調製中の高重金属濃度と脱水により蛍光と収縮の損失が起こります。(i) EM用に調製した同じ試料をLM(ii)下で観察した試料の模式図で、完全に不透明になり、体積の約10%を失う。(B)サンプル埋め込みは、典型的にはエポキシ樹脂またはアクリル樹脂を使用して行われる。従来のブロック(i)は、特定の向きを必要としない均質なサンプルに対して正常に使用できます。フラットブロック(ii)は、顕微鏡下での標的および配向に不可欠な場合に有用であり、例えば、非均質サンプルまたは相関顕微鏡の手順において、断面化を目的とした正確な領域である。(C)サンプル体積全体のうち、1つの50 nmセクションに限られた分数のみが表され、3Dサンプルの2D画像を提供し、しばしば不慣れな向きに表示される。(D)過度に大きなボリュームと正確なターゲティングを記録する問題を説明するために、1000、500、50μmの面を持つ3つの同心円キューブを選択し、仮説的な1000 x 500 x 500 μmサンプル(ダークマルーン)を含むように構成しました。このような仮説的なサンプルキューブが50nmのスライスで完全に切り離されている場合、ボリューム全体をカバーするために、合計20,000、10,000、および1,000スライス、および800 tb、100 tb、および100 gb(イメージング解像度5 nm x 5nm x 50nm、8ビット)が必要です。これは、必要最小限の量を取得するためだけに、EMデータの取得を計画することの重要性を示しています。(E) 大きなサンプル表面積を高解像度でカバーすると、大きなボリュームと同様の問題が発生します。複数の高解像度の画像を 1 つに分割することは、このような問題に対する役立つ解決策です。ただし、2024 x 1048 フレームを 10,000 倍の倍率で使用して 1 mm x 1 mm の表面を覆うには、膨大な数のタイルが必要になり、ステッチが難しくなる可能性があります。さらに、切断時にセクションが可変的に圧縮または歪んでいる場合、結果のデータスタックは整列することがほとんど不可能になります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:大きなサポート上のセクションの配列を直接生成するためのワークフロー。 このステップは、ブロックの平行な側面を確保し、またサンプルの周りの空の樹脂を減らすのに役立ちます。 (B) At セクション取得用の修正ナイフ。大型ボートは、サンプルの切り離し、サポート上の転送中にセクションとその操作の転送を容易にします。大きな洗面器はセクションの操作を可能にする;排水システムは、排水ステップ中にリボンの動きを制限し、フラットボトムは、信頼性の高いサポートの徐々乾燥を行います。(C)ナイフは、水面の底に置かれたグロー放電ウエハと、エッジに平準化された水で切り離す準備ができています。ナイフの構造は、サポートを妨げることなく、針を埋め込み続けます。(D) 配列生成、ミクロトーム断面領域のトップビュー。(i) 最初のセクションは、通常、互いに固執し、通常のリボンを形成するので、入手が容易です。(ii) リボンにセクションが追加され、長くなると、リボンの安定性が失われ、頻繁にカーブが行われます。画像取得の手順に備えて、シーケンストラックを順番に整理しておくことが重要です。(iii) セクションのリボンが所望の長さに達すると、まつげを使用してナイフエッジから慎重に取り外されます。(iv) 水は流域から排出される。ウエハーは完全に空気乾燥するまで内部に残ります。セクションをまっすぐにし、マイクロフォールドの形成を避けるのに役立つため、このステップは不可欠です。ウエハーは、サポート上のセクションを取り付けるために、少なくとも30分間、60°Cでオーブンに置かれます。(E)移管されたセクションを有するウェーハの例。まっすぐで正確なリボンを得ることは便利ですが、実際のサンプルは、ほとんどの場合、このような理想的なリボンの形成を防ぎます。それにもかかわらず、「ずさんな」リボンでさえ、膨大な数のケースにとって非常に有益であり、「きちんとした」リボンの重要性は、セクションが収集される研究戦略に依存します。スケールバー 1cm(F)シリアルセクションを使用したスロットグリッドの例。1つのグリッドに多数のセクションが集められる場合でも、単一のウエハで収集できる部分はごく一部です。グリッド上のセクションの移動をマスターするために必要なスキル(特にスロットグリッド)は、電子顕微鏡サンプル調製を習得するための重大なボトルネックを表しました。スケールバー500μm(G)どのセクション収集方法を使用しても、ATアプローチの強みは、オングリッドコレクションと比較して、シーケンシャルセクションの生成の相対的な容易さです。1000 μm x 500 μm サンプルブロックを考慮すると、2 cm x 4 cm のウェハ(i)に100個のセクションを収めるのに問題ありません。スロットグリッド上の同じサイズのセクションは、最大で3つのセクション/グリッドにのみ収まります(ii)。グリッド上のシリアルセクションを収集する難しさについては触れず、同じセクション数をカバーするために必要なグリッドの数を示すスケーリングされた画像を提供します。スケールバー= 1 cm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:アレイ断層化ワークフローの重要なステップ 高解像度イメージ スタックの無人取得のワークフローの概略図。すべての準備ステップは自動化されており(緑色の歯車シンボル)、セクションごとに手動で実行する必要はありません。画像スタックは、自動剛性またはアフィンアライメントが可能な任意の画像解析ソフトウェアで整列させることができます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:ショウジョウバエの成人腸をデモンストレーションモデルとして用いた3つの買収シナリオ(A) 剖剖後ショウジョウバエの中腸の描画, 異なる色で指定された3つの主要な領域を持つ: 前, 中間, 後部.(B) 腸が横断断面に向いている整った平坦なブロック。なお、空の樹脂量は、対象領域(白色の長方形)を含む組織のまわりで慎重にバランスが取れている。(C)横シリアルセクションは、ATナイフの洗面体内の水面に浮かんでいる。全ての画像は、逆対比のミラー検出器を用いて、二次電子SEMモードで取得した。(D) ウェーハ上の横シリアルセクションのモザイク画像をステッチ。スケールバーは1000μm(E)ショウジョウバエ腸を通る断面である。スケールバー20 μm。画像は7 x 7中間範囲の画像のステッチモザイクです。インセット – 関心のある特定の領域のより高い倍率および分解能画像:(ii)核、(iii)ブラシの境界線、および(i)ミトコンドリア。スケールバー5 μm すべて。(F) 細胞の発生場所をターゲットとする腸内を通る横断面の中間画像(正方形)。スケールバーは20 μmです(G) パネルFに存在するセクションの分析中に局所化された領域に基づいて収集されたシリアルセクションのターゲット配列は10 μmです。 図5: ATアプリケーションシナリオのケーススタディ(A)腸管オルガノイドにおける異なる細胞構造の局在化(i) 埋め込みシリコンマイクロチップ。スケールバー= 200 μm. (ii) チップの中央部を通る127の断面のステッチモザイク画像。スケールバー= 1500 μm (iii) 腸オルガノイドの部分を通る完全な横切り部の4つの低解像度画像。矢印は、関心のある潜在的なサイトを指しています。スケールバーは20 μm(iv)異なるROIで、さらなる分析のために選択された低解像度の顕微鏡写真をターゲットにしています。スケールバー= 10 μm( v) 感染した対象細胞の高解像度画像。隣接するセクション内の同じ領域を分析すると、必要に応じてターゲットを絞った 3D 情報を提供できます。スケールバー=5μm(B)ショウジョウバエメラノガスタープパルノタムにおける中身体の局在化。(i) 解剖されたショウジョウバエの子犬の概略図。保護キューティクルの一部を除去した後の解剖(ベージュ)のために露出したノータム(茶色)。黒い線は、(ii) 図で示された領域を通る断面の方向を示します。画像は、1つのモザイクパネルにステッチされた3×7連続して撮影された高解像度SEM画像を組み合わせたものです。黒い四角形は、分割セルを含む領域を区切ります。スケールバーは15μm(iii)パネルiiから分割セル上のズーム画像である。この倍率と解像度では、ミッドボディが明らか(白い矢印)です。セクション全体が分析され、分割セルが見つかります。横のスクリーニングのステップの間に20-30セクション間隔のセクションの異なったリボン間の跳躍は多数の分裂細胞の対を局的にする。スケールバーは、分割セルが局在化する場合に5μm(iv)、パネル内の黄色い四角で区切られたミッドボディの周囲の4つのセクションから収集された中型の逐次画像(iii)。。スケールバーはマウス視床下部における1μm(C)のタニサイトエンドフィート局在化である。(i)ビブラートメスライスの蛍光画像。タキサイトはtdトマト蛍光タンパク質(赤色)を発現する。白い四角形は対象領域を区切ります。スケールバー500 μm(ii) EM用に用意された同じビブラートオームセクションは、パネル(i)からの蛍光情報の間接的な相関に基づいて、関心領域の周りに慎重にトリミングされます。点線の白い線は、超薄い断面の面積を表します。スケールバーは両方のパネルのための50 μmである。(iii) 対象領域のビブラートメスライスを通して断面。SEMモザイク画像は75枚のステッチ画像で構成されています。いくつかのセクションは、横スクリーニングによってターゲットとされ、同様のパラメータで画像化されます。セクションはROIを見つけるために「オフライン」で分析されます – タニサイトの端足。黒い長方形は、タニーサイトの端足を含む領域を表します。このセクションは、さらなる分析のためのアンカーとして機能します。スケールバーは15μm(iv)血管を取り囲むタニサイトのエンドフィートの高解像度、高倍率画像です。1つのセクションでROIの初期ローカリゼーションが行った後、zシーケンスは隣接するセクションからアンカーセクション(パネルiii)に向けて集められます。スケールバー5 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図6:超ミクロトミー、セクションコレクション、セクション保存中の問題は、アーティファクトにつながる可能性があります。 空の樹脂のほとんどは、組織から取り外され、それ自体(セピア)に折り畳まれた。破線の黒いボックスは、セクション全体を含めるために使用される領域を示します。スケールバー500 μm(B)50nm厚のゼブラフィッシュセクションの表面に小さく、局所的な折り目。スケールバー 1 μm(C) 70nmマウス脳部の表面にナイフマーク。スケールバー 5 μm(D) ゼブラフィッシュ筋部を部分的に覆うウエハ表面の髪(アスタリスク)黄色では、組織は分析のために標的にされる。ピンク色のセルは、影響を受ける領域のサイズの基準として使用されます。スケールバー 50 μm. (E) ゼブラフィッシュの脊索と右下にしわが付き (黒い矢印) 、 密度の高い神経組織 (青で影) が柔らかい筋肉組織と空の樹脂 (黒い矢印) に接しています。スケールバー10μm(F)Eのように50枚の画像の積層の体積セグメンテーションは、この領域がほとんどのセクションでしわを示したことを示した。破線ポリゴンは、F と同じボリュームセグメンテーションの G. Scale バー 10μm(G)XY ビューに表示される領域の輪郭を描き、ブロックの右半分に短い黒いストロークとしてシワを示します。なお、組織の残りの部分におけるスタックの位置合わせは、シワの影響を受けません。Gと同じ領域のスケールバー5μm(H)XZ投影は、全50区間のしわを示す。スケールバー5 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補足映画1:ショウジョウバエ前腸を通る断面の高解像度モンタージュ画像。反転した SE-MD SEM 画像のモザイク画像。352の別々のイメージタイルは5 nmの決断で自動的に獲得され、全体の横断を提示するためにステッチされた。同じ画像を使用して、より詳細なズームインを行い、データを網羅的にカバーすることが可能です。タイトな接合、微小管、異なるタイプの小胞は、ズームインするときにすることができます。スケールバーは10μmです。この映画をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。 補足映画2: ショウジョウバエ 腸細胞のレンダリング。 腸細胞を分割する領域のセクションの50整列モザイク画像。セルの境界(青、ターコイズ、オレンジ)と核(白)のIMODレンダリング。この映画をダウンロードするには、ここをクリックしてください。 補足材料。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。