سير عمل التصوير المقطعي للصفيف للحصول المستهدف على معلومات الحجم باستخدام المجهر الإلكتروني المسح الضوئي
Summary
نحن نصف إعداد شرائط من المقاطع التسلسلية وجمعها على دعم نقل كبير لاستخدامها كعينات التصوير المقطعي الصفيف، جنبا إلى جنب مع إجراءات التصوير الآلي في المجهر الإلكتروني المسح الضوئي. يسمح البروتوكول بفحص واسترجاع وتصوير مستهدف للأحداث المحلية النادرة، والحصول على كميات كبيرة من البيانات.
Abstract
يتم تطبيق المجهر الإلكتروني في علم الأحياء والطب لتصوير التفاصيل الخلوية والهيكلية بدقة نانومتر. تاريخيا، قدم المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM) نظرة ثاقبة في البنية الفوقية الخلية، ولكن في العقد الأخير، وتطوير المجاهر الإلكترونية المسح الضوئي الحديثة (SEM) قد غيرت طريقة النظر داخل الخلايا. على الرغم من أن دقة TEM متفوقة عندما تكون هناك حاجة إلى تفاصيل هيكلية على مستوى البروتين ، فإن دقة SEM كافية لغالبية الأسئلة المتعلقة ببيولوجيا الخلايا على مستوى الجهاز. مكن التقدم في التكنولوجيا حلول الاستحواذ التلقائي على الحجم مثل التصوير التسلسلي لوجه الكتلة (SBF-SEM) وشعاع الأيونات المركز SEM (FIB-SEM). ومع ذلك، تظل هذه الأساليب حتى يومنا هذا غير فعالة عندما يكون تحديد الهوية والملاحة إلى المناطق ذات الاهتمام أمرا حاسما. وبدون وسائل التوطين الدقيق للمناطق المستهدفة قبل التصوير، يحتاج المشغلون إلى الحصول على بيانات أكثر بكثير مما يحتاجون إليه (في SBF-SEM)، أو الأسوأ من ذلك، إعداد العديد من الشبكات وتصويرها جميعا (في TEM). نقترح استراتيجية “الفحص الجانبي” باستخدام التصوير المقطعي للصفيف في SEM ، مما يسهل توطين المناطق ذات الاهتمام ، يليه التصوير الآلي للكسر ذي الصلة من إجمالي حجم العينة. يتم حفظ عينات التصوير المقطعي الصفيف أثناء التصوير، ويمكن ترتيبها في مكتبات القسم جاهزة للتصوير المتكرر. تظهر العديد من الأمثلة التي يتيح لنا فيها الفحص الجانبي تحليل التفاصيل الهيكلية التي تشكل تحديا لا يصدق للوصول إليها باستخدام أي طريقة أخرى.
Introduction
على الرغم من أهمية التقنيات المتعلقة ب EM ، فإن الجهد المطلوب لإتقانها يبقي المجال بأكمله مقتصرا على عدد قليل من المتخصصين. وتتمثل إحدى الصعوبات الكبيرة في تحديد واسترجاع منطقة الاهتمام في العينات المحفوظة في منطقة الطوارئ. يختلف مظهر العينة نفسها بشكل كبير عند تحليلها عن طريق المجهر البصري وبعد المعالجة لمراقبة EM. وتشمل التغييرات لعينات أعدت كيميائيا انكماش عينة النظائر بعد خطوات الجفاف (~ 10٪ في كل البعد) وفقدان الفلورسينس عند استخدام الأوسميوم في التثبيت وتلطيخ البروتوكول (الشكل 1A). بالنسبة للأقسام فائقة النحافة ، يتم تضمين العينات في راتنجات الايبوكسي أو الأكريليك باستخدام استراتيجيات مختلفة(الشكل 1B). للحصول على نتائج ناجحة لهذا الإعداد، يجب تقسيم العينة بأكملها إلى قطع لا تتجاوز 1 مم × 1 مم. لتلبية متطلبات المراقبة القياسية الخاصة بالمنظار الإلكتروني للإلكترون (TEM)، يتم تقسيم هذا الجزء الصغير من العينة إلى شرائح سمكها 50-150 نانومتر. تظهر الصور الرمادية الناتجة تنظيم الأنسجة وبنية العضية لجزء صغير من العينة بأكملها بتفاصيل أكبر من أي تقنية مجهرية أخرى(الشكل 1C). توفر مجموعة بيانات TEM النموذجية معلومات ثلاثية الأبعاد ، استقراء نظريا لفهم العمليات التي تحدث بشكل طبيعي في مساحة ثلاثية الأبعاد في الخلايا والأنسجة. الشكل 1D يمثل التحدي المتمثل في اقتناء أحجام ultrastructural: إذا كان مكعب من جانب 1000 ميكرومتر مقطعة في سمك 50 نانومتر، وسوف تكون هناك حاجة 20000 أقسام لتغطية حجم كامل؛ لمكعب جانبي 500 ميكرومتر، سيكون 10،000 مقطع. لتغطية حجم 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر × 50 ميكرومتر، قد يكون من الضروري وجود 1000 مقطع “فقط”. الحصول على وحدة التخزين هذه يدويا هو عمليا مستحيلة وصعبة للغاية لأداء مع التشغيل الآلي. إذا، بالإضافة إلى عمق العينة، ونحن بحاجة لتغطية كامل سطح هذه المكعبات افتراضية، وتغطيةسطح 2 1 ميكرومتر في قرار معقول يصبح مشكلة لوجستية خطيرة (الشكل 1E). وفي حين أن العدد الكبير من الأقسام بالنسبة للمشاريع غير العادية الواسعة النطاق، مثل نهج الاتصال، أمر بالغ الأهمية بالنسبة لغالبية مشاريع إعادة الطوارئ “الدنيوية”، فإن توليد المزيد من الأقسام اللازمة للمراقبة يمثل عيبا كبيرا.
هناك عدة طرق للحصول على معلومات 3D ultrastructural : تسلسل تقسيم انتقال المجهر الإلكتروني (TEM) ، TEM التصوير المقطعي ، التصوير المقطعي الصفيف (AT) ، المسلسل كتلة الوجه التصوير المجهر الإلكتروني المسح الضوئي (SBF – SEM) ، وركزت أيون شعاع المسح المجهري الإلكتروني (FIB – SEM). الاختلافات الرئيسية بين هذه الطرق هي استراتيجية الأقسام وما إذا كان الحصول على الصورة مقترنا بالمقطع1. في تقسيم تسلسلي TEM، يتم جمع المقاطع التسلسلية على شبكات القمار، يتم إنشاء صور TEM من هذه التسلسلات ومحاذاتها2و3و4و5. في التصوير المقطعي TEM، سلسلة الميل من 150-300 نانومتر أقسام على الشبكة، وعندما يقترن القسم التسلسلي، وتوفير دقة عالية جدا، علىالرغممن أحجام صغيرة نسبيا 6،7،8. يستخدم نهج AT القسمة المادية مع آداب يدوية وشبه تلقائية متنوعة من تجميع الأقسام على دعم كبير نسبيا ، مثل غطاء الزجاج أو رقائق السيليكون أو شريط خاص. للحصول على الصورة ، يتم تحليل الدعم في SEM ، مع استراتيجيات اقتناء الصور المتنوعة المتاحة9،10،11،12،13،14،15 . بالنسبة ل SBF-SEM ، يتم تحقيق التقسيم المادي باستخدام ميكروتوم صغير مع سكين ألماس تم ضبطه مباشرة داخل غرفة SEM ، مع صورة SEM الناتجة من سطح كتلة الراتنج16و17و18و19. بالنسبة ل FIB-SEM، يزيل مصدر الأيونات طبقات رقيقة من العينة، يليها التصوير التلقائي للسطح المكشوف من قبل SEM20،21. توليد التصوير المقطعي TEM و AT أقسام المادية، والتي يمكن إعادة تصويرها إذا لزم الأمر، في حين FSBF-SEM وFIB-SEM القضاء على القسم بعد التصوير. مزيج حديث من المقاطع المادية التي صورتها SEM متعددة الحزم يوفر مزيجا من الأساليب التي تحل “عنق الزجاجة” قضية سرعة الحصول على صورة22. وقد أحدثت كل من هذه التقنيات ثورة في الطريقة التي يمكن بها الحصول على بيانات EM وتحليلها ، ولكل نهج آثاره العملية المتعلقة بسؤال بحثي معين.
نظرا لطبيعة الإعداد وحجم الأبعاد فوق الهيكلية ، فإنه ليس من السهل التنبؤ بمكان وجود بنية مستهدفة محددة في كتلة العينة(Figure1D، E). أحد حلول توطين عائد الاستثمار هو تسجيل الصور من الكتلة بأكملها بالدقة المطلوبة من البداية. يمكن أن تكون الهياكل ذات الاهتمام في حجم البيانات المكتسبة عندما تكون بعيدة عن المجهر. وقت الاستحواذ ومعالجة البيانات المرتبطة بهذه الاستراتيجية هي إشكالية. من المستحسن تقليل كمية البيانات المسجلة ، خاصة إذا كانت مؤشرات الاستثمار أصغر بكثير من كتلة الأنسجة ، أي إذا كانت الأشياء ذات الأهمية أنواعا محددة من الخلايا (وليس أعضاء كاملة). يمكن أن تكون تقنيات المجهر المختلفة ذات الصلة للضوء والإلكترون (CLEM) ناجحة عندما يتم الحفاظ على الفلورية ومحلية قبل أو بعد التحضير داخل نفس العينة23،24،25،26،27،28،29. ومع ذلك ، يمكن التعرف على العديد من الهياكل الخلوية حتى بدون ارتباط مضان ، فقط على أساس البنية الفوقية المعروفة. بالنسبة لهذه الحالات، نعتقد أن الفحص الجانبي للتصوير المقطعي للصفيف يوفر مقايضة متوازنة بين الجهد المستثمر في توطين عائد الاستثمار وجودة المعلومات فائقة البنية. وباستخدام هذه الاستراتيجية، يتم فحص مجموعة فرعية من الأقسام على الرقاقة في فترات منتظمة، والتي يمكن إنشاؤها استنادا إلى حجم العائد على الاستثمار وطبيعته. بمجرد العثور على ROIs ، يتم إعداد اكتساب البيانات في سلسلة مستمرة من الأقسام بدءا من قبل وتنتهي بعد قسم الارتساء ، وجمع المعلومات ذات الصلة بطريقة مستهدفة.
نقدم بروتوكولات ل AT تعمل على تبسيط وتسريع الحصول على المناطق أو الأحداث ذات الاهتمام في العديد من الأقسام وتسفر عن أحجام صور أكثر توافقا. وينتج عن الفحص الجانبي والحصول على الخطوات المتعددة بيانات ذات دقة عالية جدا في المناطق المستهدفة بدقة. يعالج الإجراء الذي نصفه العديد من التحديات المتعلقة بالحصول على بيانات 3D EM ، حيث ينص على: التوافق مع مجموعة واسعة من العينات دون تغيير جذري في سير عمل إعداد العينة ؛ ترجمة مستهدفة لعمليات الاقتناء بالأقسام وSEM؛ تقليل الوقت والجهد أثناء الإعداد؛ تصوير المناطق في أقسام متعددة مع محاذاة أفضل للأحجام الناتجة؛ وإجراء خياطة ومحاذاة سلس لتجميع صور مختلفة في صورة فسيفساء مخيط. اخترنا أن نظهر قوة طريقتنا مع عدة عينات من المشاريع المنشورة والجارية. ونحن نعتقد أن هذا النهج يمكن أن يسهل بشكل كبير توليد والحصول على بيانات EM المستهدفة، حتى بالنسبة للمحققين ذوي الخبرة المحدودة في مجال إدارة الطوارئ.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعطي المجهر الإلكتروني نظرة ثاقبة على البنية الفوقية للخلايا والكائنات الحية ، والتي غالبا ما يكون من المرغوب فيه تصوير الهياكل ذات الاهتمام في سياقها ثلاثي الأبعاد. على الرغم من العديد من تكتيكات EM للتحليل الهيكلي الفائق ، لا يوجد حتى الآن حل “معيار الذهب”. والسبب الرئيسي هو التنوع الواسع في العينات، والعديد من الأسئلة البيولوجية، التي تتطلب في كثير من الأحيان نهجا مصمما خصيصا. تم تصميم سير العمل المقترح AT لتقليل الوقت اللازم لمعالجة العينات، والحصول على البيانات، والتقييم، والتخزين. وعلاوة على ذلك، يوفر السكين المعدلة أداة مفيدة لتبسيط اكتساب الصفيف. التصميم المدمج للأقسام على رقائق مريحة، سواء بالنسبة للمراقبة والتخزين اللاحقة للعينات. ويتيح هذا الترتيب “الفحص الجانبي” للعينات عن طريق الانتقال أفقيا من الشريط إلى الشريط ومسح قسم واحد فقط في كل منها، مما يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم لترجمة عائد الاستثمار. 10 – وتيسر سيناريوهات الحصول على البيانات المقترحة استهداف المناطق الصغيرة والموزعة عشوائيا. بمجرد العثور عليها، AT/ SEM يقيد التصوير عالي الدقة بدقة إلى حجم الاهتمام، سواء تم إجراؤه يدويا أو بمساعدة وظيفة تلقائية. يمكن إكمال AT لوحدات التخزين المحدودة يدويا ، مع تنقل المشغل عبر العينة وتحديد مناطق التصوير واحدا تلو الآخر. توفر الوحدة الآلية للبرنامج استراتيجية مرنة لاكتساب الصور لتصوير المناطق الصغيرة في أقسام كبيرة. الأتمتة في هذا البرنامج يسمح بتسجيل صور كبيرة عالية الدقة على مئات الأقسام ، وتحقيق وحدات تخزين مماثلة لSBFI. يؤدي تسجيل صور نظرة عامة على جميع الأقسام إلى تبسيط توطين عائد الاستثمار وتقليل الوقت الذي يقضيه في المجهر. وبما أن المقاطع لا تتضرر أثناء تسجيل المعاينات ذات الدقة العالية، فإن AT/SEM تسمح بإعادة استخدام العينة لجمع المزيد من البيانات عن العائد على الاستثمارات الأخرى أو بدقة أعلى.
وقت الحصول على الصورة هو واحد من أهم (وأغلى) جوانب 3D EM ولذلك ينبغي النظر في تصميم التجربة. في حين أنه ليس من المستغرب أن يستغرق التصوير مساحات كبيرة وقتا أطول من مناطق التصوير الصغيرة ، فمن السهل تقليل تقدير التأثير: اعتمادا على معلمات التصوير المحددة ، يمكن أن يختلف وقت الاستحواذ في كل قسم من ثوان إلى ساعات. تتضمن معلمات التصوير الحرجة حجم مجال الرؤية والدقة ووقت الإسهاب. على افتراض دقة الهدف من 10nm لكل بكسل و 1 ميكروس يسكن الوقت، والتصوير حقل من 20 ميكرومتر × 20 ميكرومتر، 100 ميكرومتر x100 ميكرومتر، أو 500 ميكرومتر x 500 ميكرومتر يستغرق 4 ثوان، 100 ثانية، أو 2500 ثانية للتسجيل. يمكننا مضاعفة هذه الأوقات التصوير لكل قسم من قبل عدد من المقاطع لتقدير الوقت اللازم لمهمة التصوير الكامل. يمكن أن تكون أوقات التصوير الطويلة لكل قسم مقبولة إذا كان عدد المقاطع صغيرا أو إذا كان وقت أداة المجهر غير مثير للقلق.
ومع ذلك، فمن الضروري الحد من وقت التسجيل إلى وظيفة بين عشية وضحاها أو وظيفة في عطلة نهاية الأسبوع في معظم الحالات. جانب حرج بنفس القدر من 3D EM التي ينبغي النظر فيها ، هو مقدار وهيكل البيانات الناتجة عن الصورة. تسجيل حقول التصوير المذكورة أعلاه في 100 قسم يولد 400 ميغابايت، 10 غيغابايت، أو 250 غيغابايت من بيانات الصورة، على التوالي؛ تشكل الصور 500 ميكرومتر × 500 ميكرومتر مشكلة إضافية وهي أن تكون أكبر من 2 غيغابايت لكل منها. لا يمكن للعديد من البرامج المستخدمة لتقييم البيانات فتح صور بهذا الحجم.
لتقليل وقت التصوير، من المهم اختيار وقت البكسل لتلبية متطلبات نسبة الإشارة إلى الضوضاء لتقييم البيانات اللاحق (على سبيل المثال، إعادة البناء والتتبع)، والحد من التسجيلات إلى مؤشرات استثمار محددة. تمديد AT للبرنامج يسهل الحصول على الصور في مناطق صغيرة في الأقسام التسلسلية. يدعم البرنامج سير العمل اليدوي والتلقائي والعديد من المتغيرات شبه التلقائية: يمكن وضع مناطق التصوير يدويا وتركيزها على كل قسم ، أو يمكن للمستخدم استخدام مكتشف القسم التلقائي وميزات محاذاة الموضع. اعتمادا على مستوى التشغيل الآلي الذي تم اختياره ودعمه من قبل نوع العينة أو أهداف التصوير ، يمكن أن يستغرق الوقت اللازم لإعداد اكتساب الصورة في مئات الأقسام يوم عمل كامل (يتم يدويا) أو بضع دقائق فقط. من حيث المبدأ، التصوير المقطعي الصفيف يجعل من الصعب أكثر من غيرها من أساليب EM 3D للحصول على ROIs الصغيرة. يجب تعويض وضع المنطقة غير الدقيق في أقسام متتالية من خلال الحصول على مساحات أكبر. على سبيل المثال، إذا كان عائد الاستثمار 20 ميكرومتر × 20 ميكرومتر في الحجم وتقلب موضع من قسم إلى قسم لحقول التصوير هو 10μm، يحتاج المرء إلى الحصول على صور 40 ميكرومتر × 40 ميكرومتر للتأكد من أن عائد الاستثمار يتم التقاطه بالكامل في كل صورة، في كل قسم. يتراوح تباين موضع الصورة في العالم الحقيقي من 100 ميكرومتر إلى <10 ميكرومتر اعتمادا على توافر أو جودة ميزات البرامج لمحاذاة الموضع أو صبر المستخدم. مع هذا البرنامج، يمكن تحقيق 10 ميكرومتر دون تدخل يدوي أكثر من اللازم في معظم العينات.
مثل أي تقنية ، AT لديها العديد من نقاط الضعف التي يمكن أن تؤثر على الحصول على البيانات الناجحة ، والعديد منها مشابهة لطرق أخرى تستند إلى الأقسام. عدم وجود توزيع متجانسة من الراتنج فارغة مقابل الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى صفائف منحنية أو مكسورة. في الحالات القصوى، يمكن فصل المقاطع من الدعم (الشكل 6A). ضغط متغير أو تمتد خلال عملية القطع يمكن إنشاء طيات التي يمكن أن تعطل العينة في مناطق متغيرة على المقاطع اللاحقة (الشكل 6B). يمكن أن تظهر علامات السكين على سطح المقاطع التي تم جمعها باستخدام سكين معطوبة(الشكل 6C). يمكن أن تؤدي الاختلافات في ظروف القسمة إلى ضغط المقطع العرضي واختلافات السماكة. الغبار أو الأوساخ الجسيمات يمكن أن تهبط على قسم وحجب جزئيا منطقة الاهتمام (الشكل 6D). يمكن أن تفشل عملية الحصول على الصور بسبب التباين التلقائي الناقص والتركيز التلقائي ووظائف الوصم التلقائي. يمكن أن يكون موضع مناطق التصوير التي تم إنشاؤها تلقائيا متغيرا وقد يفشل في التقاط عائد الاستثمار في جميع الأقسام.
يمكن أن تنشأ عدة مشاكل في مرحلة خياطة والمحاذاة. يمكن أن تفشل الخياطة التلقائية لمقتنيات بلاط الفسيفساء ، على سبيل المثال ، بسبب المساحة الفارغة الكبيرة داخل العينة. نظرا لتغيير جذري في الشكل في 3D ، يمكن أن تكون أكوام الصور صعبة للتسجيل. البرامج المطورة خصيصا (على سبيل المثال، IMOD، فيجي، TrackEM2، MIB، أو MAPS-AT) يمكن أن تسهل المحاذاة شبهالتلقائية 32،38،39،40. يمكن محاذاة المقاطع الأكثر تحديا يدويا باستخدام برنامج تحرير الصور. لسوء الحظ، قد يكون من المستحيل محاذاة بعض مجموعات البيانات بشكل صحيح.
تشكل العينات الكبيرة تحديا للأقسام التسلسلية TEM التي تتناسب مع الشبكات؛ من ناحية أخرى، العديد من المشاريع لا تبرر اقتناء التلقائي طويلة باستخدام FIB / SEM أو SBF-SEM. و AT هو بديل مباشر لقسم المسلسل مملة TEM حيث جمع والتلاعب من المقاطع التسلسلية على رقاقة هي أكثر مباشرة مما كانت عليه مع شبكات فتحة. تم تطوير العديد من الاستراتيجيات لتسهيل جمع الصفائف ، ونحن نشارك طريقتنا لتوسيع مجموعة الأدوات الحالية. وفي الحالات التي يكون فيها تحديد عائد الاستثمار صعبا، يوفر نظام AT-SEM ميزة أساسية، مع الفحص الفعال للعينات التي يلزم فيها استبانة على نطاق عضوي في 50 إلى 500 قسم. بالنسبة للأحجام الكبيرة، يمكن جمع استراتيجيات AT التلقائية بكفاءة إذا كان هناك حاجة إلى المزيد من المقاطع. يمكن إعادة تصوير عينات AT عدة مرات ، مما يسهل التصوير المستهدف للمناطق عالية الدقة استنادا إلى صور النظرة العامة المكتسبة مسبقا. ونحن نعتقد أن التحليل المستهدف وتقليل الإفراط في الاختزال من قبل AT / SEM المقترحة هنا يقلل من متطلبات العمل وتخزين البيانات. وفي نهاية المطاف، يمكن جمع مكتبات الأقسام وصيانتها لإعادة استخدامها والتشاور بشأنها في وقت لاحق. بالنسبة لاكتساب الحجم، تقدم أساليب FIB أو SBF-SEM حلا ممتازا كلما كان من السهل تحديد عائد الاستثمار على وجه الكتلة أو إذا كانت هناك حاجة إلى وحدات تخزين ثلاثية الأبعاد كبيرة للتحليل. ومع ذلك، FIB/SBF-SEM أقل كفاءة عندما يكون صورة مكدس عالي الدقة يجب أن يتم تجميعها من عائد استثمار محدد بطريقة مستهدفة. وفي الختام، فإن الأساليب المقترحة لفحص عينات AT واستخدام صور النظرة العامة متوسطة الدقة تسمح بقصر الحصول على الصور على الأجزاء ذات الصلة من صفيف القسم. يؤدي استهداف مناطق التصوير بدقة إلى تسريع عملية نقل البيانات وتبسيط تقييم البيانات.
وباختصار، على الرغم من أن مفهوم AT/SEM ليس جديدا، فإن استخدامه لا يزال غير واسع الانتشار كما يوحي مزاياه. بشكل عام، يوفر إجراء تكميليا لأساليب EM الموجودة الأخرى. AT/ SEM متوافق مع أوسع نطاق من بروتوكولات إعداد العينة وسير عمل التصوير ويمكن القيام به على أي مجهر FIB/SEM أو SBF-SEM كبقنية مصاحبة. في هذه الورقة، ركزنا على AT لتسجيل البيانات فائقة الهيكلة من العينات التي هي أقل عرضة لمعالجتها بنجاح بطرق أخرى. ونأمل أن يساعد الإجراء الموصوف لجمع الأقسام المريح واستراتيجيات الاستحواذ الآلي إلى حد كبير في المحاولات الأولى لأولئك الذين لم يصادفوا هذه الطريقة أبدا وسيساعد على تحسينها لأولئك الذين لديهم بالفعل بعض الخبرة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أعضاء مرفق EM في جامعة لوزان على دعمهم خلال هذا التطوير لخطوات مختلفة من إجراء AT. نود أن نشكر غاريث غريفيث ومارتا رودريغز وأورسكا ريبنك وكريستل جينود وهيلموت غنايجي وعينات زيلينغر وباولا مورينو رومان ولوسي أوبراين وليندساي لويلين على المناقشات التي جرت أثناء إعداد المخطوطة والقراءة النقدية. نريد أن نعترف بالمجموعات التي ساهمت بالعينات المستخدمة لإظهار السيناريوهات المختلفة: ماتياس لوتولف، ميخائيل نيكولاييف، ديفانجالي دوتا، تيل ماتزات، وفاني لانغليت.
Materials
| Cutting | |||
| AT sectioning knife | Diatome | DUATS3530 | Diatome Jumbo knife |
| Diamond knife for trimming 90° | Diatome | DTB90 | Diatome trimming 20° Glass knife |
| Pattex contact adhesive | Pattex | PCL3C | |
| Silicon wafer | Ted Pella | 16015 | Resistance: 1-30 Ohms Type P: (Boron) (1 primary flat) Roughness: 2 nm No SiO2 top coating TTV: = <20 µm Wafer is polished on one side |
| Ultramicrotome | Leica UC6 | Alternative: Leica UC7 | |
| Wafer cleaving kit | EMS | 7642 | EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652 |
| Image acquisition | |||
| FESEM | Thermo Fischer Helios | 1072419 | Alternatives: Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN |
| Maps 3 for SEM with Correlative Workflow & Array Tomography | Thermo Fisher Scientific | 1135932 | Maps provides automation of SEM imaging workflows and allows importing of 3rd party data for CLEM and navigation. |
| Image analysis | |||
| Amira x.y | Thermo Fisher Scientific | 1131599 | Amira is a 3D data visualization and analysis software with several practical functions for Array Tomography data reconstruction. |
| Image processing | Open source | Fiji (http://fiji.sc/#download) | IMOD, MIB (See text for refferences) |
References
- Luckner, M., Wanner, G. From light microscopy to analytical scanning electron microscopy (SEM) and focused ion beam (FIB)/SEM in biology: Fixed coordinates, flat embedding, absolute references. Microscopy and Microanalysis. 24 (5), 526-544 (2018).
- White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transaction of Royal Society of London B Biological Sciences. 314 (1165), 1 (1986).
- Zheng, Z., et al. A complete electron microscopy volume of the brain of adult Drosophila melanogaster. Cell. 174 (3), 730-743 (2018).
- Mulcahy, B., et al. A pipeline for volume electron microscopy of the caenorhabditis elegans nervous system. Frontiers in Neural Circuits. 12, 94 (2018).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Baumeister, W., Grimm, R., Walz, J. Electron tomography of molecules and cells. Trends in Cell Biology. 9 (2), 81-85 (1999).
- Hoog, J. L., et al. Organization of interphase microtubules in fission yeast analyzed by electron tomography. Developmental Cell. 12 (3), 349-361 (2007).
- Weber, M. S., Wojtynek, M., Medalia, O. Cellular and structural studies of eukaryotic cells by cryo-electron tomography. Cells. 8 (1), 57 (2019).
- Micheva, K. D., Smith, S. J. Array tomography: a new tool for imaging the molecular architecture and ultrastructure of neural circuits. Neuron. 55 (1), 25-36 (2007).
- Horstmann, H., Korber, C., Satzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), 35172 (2012).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 8, 68 (2014).
- Kubota, Y., et al. A carbon nanotube tape for serial-section electron microscopy of brain ultrastructure. Nature Communication. 9 (1), 437 (2018).
- Wacker, I. U., et al. Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes. Journal of Visualized Experiments. (133), e57059 (2018).
- Burel, A., et al. A targeted 3D EM and correlative microscopy method using SEM array tomography. Development. 145 (12), (2018).
- Templier, T. MagC, magnetic collection of ultrathin sections for volumetric correlative light and electron microscopy. Elife. 8, 45696 (2019).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology. 2 (11), 329 (2004).
- Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling. Journal of Neuroscience. 28 (12), 2959-2964 (2008).
- Wanner, A. A., Genoud, C., Masudi, T., Siksou, L., Friedrich, R. W. Dense EM-based reconstruction of the interglomerular projectome in the zebrafish olfactory bulb. Nature Neuroscience. 19 (6), 816-825 (2016).
- Smith, D., Starborg, T. Serial block face scanning electron microscopy in cell biology: Applications and technology. Tissue Cell. 57, 111-122 (2019).
- Kizilyaprak, C., Bittermann, A. G., Daraspe, J., Humbel, B. M. FIB-SEM tomography in biology. Methods in Molecular Biology. 1117, 541-558 (2014).
- Xu, C. S., et al. Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging. Elife. 6, 25916 (2017).
- Hayworth, K. J., et al. Gas cluster ion beam SEM for imaging of large tissue samples with 10 nm isotropic resolution. Nature Methods. 17 (1), 68-71 (2020).
- Maco, B., et al. Correlative in vivo 2 photon and focused ion beam scanning electron microscopy of cortical neurons. PLoS One. 8 (2), 57405 (2013).
- Russell, M. R., et al. 3D correlative light and electron microscopy of cultured cells using serial blockface scanning electron microscopy. Journal of Cell Science. 130 (1), 278-291 (2017).
- Lucas, M. S., Gunthert, M., Gasser, P., Lucas, F., Wepf, R. Bridging microscopes: 3D correlative light and scanning electron microscopy of complex biological structures. Methods in Cell Biology. 111, 325-356 (2012).
- Koga, D., Kusumi, S., Bochimoto, H., Watanabe, T., Ushiki, T. Correlative light and scanning electron microscopy for observing the three-dimensional ultrastructure of membranous cell organelles in relation to their molecular components. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (12), 968-979 (2015).
- Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
- Markert, S. M., et al. 3D subcellular localization with superresolution array tomography on ultrathin sections of various species. Methods in Cell Biology. 140, 21-47 (2017).
- Kolotuev, I., Schwab, Y., Labouesse, M. A precise and rapid mapping protocol for correlative light and electron microscopy of small invertebrate organisms. Biology of the Cell. 102 (2), 121-132 (2009).
- Kolotuev, I. Positional correlative anatomy of invertebrate model organisms increases efficiency of TEM data production. Microscopy and Microanalysis. 20 (5), 1392-1403 (2014).
- Kato, M., Kolotuev, I., Cunha, A., Gharib, S., Sternberg, P. W. Extrasynaptic acetylcholine signaling through a muscarinic receptor regulates cell migration. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (1), e1904338118 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Nikolaev, M., et al. Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis. Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Daniel, E., et al. Coordination of septate junctions assembly and completion of cytokinesis in proliferative epithelial tissues. Current Biology. 28 (9), 1380-1391 (2018).
- Pasquettaz, R., et al. Peculiar protrusions along tanycyte processes face diverse neural and non-neural cell types in the hypothalamic parenchyma. Journal of Comparative Neurology. , (2020).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).
- Cardona, A., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLoS One. 7 (6), 38011 (2012).
- Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. Microscopy image browser: A platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets. PLoS Biology. 14 (1), 1002340 (2016).
