طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

وقد تم التحقق من صحة العديد من تقنيات إزالة الأنسجة للاستخدام في الدماغ: الهيدروجيل، والهيدروفيلي، والماء. وتهدف هذه التقنيات لتحويل نسيج شفاف من خلال delipidation، إزالة اللون، والشارات عن طريق إدارة المذيبات. بمجرد أن يطابق مؤشر الانكسار لعينة الأنسجة مؤشر الانكسار لوسط التصوير المختار ، يمكن الحصول على صورة واضحة للعينة. تقنيات هيدروجيل القائمة، مثل وضوح، الجزيئات الحيوية آمنة في الأنسجة عن طريق ربطها إلى الهيدروجيلات المستندة إلى الأكرييل، والذي يمنع الضرر الهيكلي وفقدان البروتينات¹. ومع ذلك، تستخدم تقنيات الهيدروجيل مواد كيميائية قاسية من القدرة على إتلاف الأنسجة الأكثر هشاشة، وقد لا تكون عينات الأنسجة الأكثر كثافة متوافقة مع بروتوكول الهيدروجيل. قد تتطلب بعض تقنيات الهيدروجيل معدات باهظة الثمن أو تؤدي إلى توسيع الأنسجة. تقنيات هيدروفيليك، مثل CUBIC، والحفاظ على بنية 3D من خلال تشكيل روابط الهيدروجين داخل الأنسجة². يمكن أن يحدث توسع الأنسجة أيضا في بروتوكول هيدروفيلي معين. قدرة تطهير تقنيات المياه في كثير من الأحيان لا تتطابق مع القدرة التي تقنيات الكارهة للماء لديها، وهو أمر مهم للأنسجة أكثر كثافة وأكثر سمكا³.

تقنيات رهاب الماء عادة ما تكون سريعة، لا تتطلب معدات خاصة، وإنتاج عينة التي يسهل التعامل معها وتخزينها. iDISCO هو تقنية مسعورة تقضي على الانكماش الذي يمكن أن يحدث في بروتوكول مسعور آخر. في الأصل ، وصفت تقنية إزالة الأنسجة iDISCO من قبل رينييه وآخرون⁴ للأجنة والأعضاء الكثيفة والبالغة للفئران. هذه التقنية يزيل الماء من الأنسجة في خطوة الجفاف الأولي، وبالتالي الحد من تشتت الضوء. يتم اختراق الأنسجة أثناء المعالجة المسبقة للسماح بتغلغل الأجسام المضادة العميقة. وتستخدم الأصباغ اليكسا فلور في الطيف الأحمر البعيد ل immunolabeling لتجنب autofluorescence من الأنسجة في الأطوال الموجية أقل⁵. الأنسجة التي خضعت لبروتوكولات إزالة رهاب الماء قادرة على التعامل معها بسهولة ويمكن تصويرها عدة مرات بسبب طول عمر أصباغ أليكسا فلور. إذا تم تخزينها بشكل صحيح ، يمكن للأنسجة توفير الصور لعدة أشهر إلى سنة بعد المعالجة الأولية.

في هذا البروتوكول، تم استخدام الأجسام المضادة التيروزين هيدروكسيلوكس (TH)، والأجسام المضادة Iba1، والكوليرا السم Subunit B (CTB) على كل من الذكور والإناث السيطرة وفيروس نقص المناعة البشرية-1 المعدلة وراثيا (TG) أدمغة الفئران. يمتلك فأر HIV-1 Tg سبعة من الجينات التسعة التي تشكل الجينوم الفيروسي HIV-1 ، مما يؤدي إلى نموذج غير معد للتعرض الطويل الأجل للبروتين HIV-1^6و7و8. وقد أظهرت سابقا التعديلات الدوبامين في الفئران TG HIV-1، وفيروس نقص المناعة البشرية-1 نفسه هو مرض التهابي، لذلك كان اختيار الأجسام المضادة ذات الصلة لتصميم التجريبية^{9،10،11،12}. CTB هو التتبع الذي يعلق على الخلايا العصبية عن طريق ربط ganglioside ويمكن استخدامها لتتبع التوقعات afferent في الدماغ. وقد سبق أن استخدمت CTB لدراسة التوقعات من نواة accumbens إلى منطقة نيغرا substantia, منطقتين من الدماغ تشارك بشكل كبير مع مسارات الدوبامين^13,14,15.

في هذا البروتوكول، سوف TH بمثابة علامة لإنتاج الدوبامين، وسوف Iba1 علامة microglia تنشيط. الأجسام المضادة TH تستخدم تسميات انتقائية شريط واحد في حوالي 62 كيلودا التي تتوافق مع هيدروكسيلاز التيروزين. يتوافق الجسم المضاد Iba1 مع تسلسل Iba1 carboxy-terminal. وقد تربى كلا الجسمين المضادين في أرنب وكانت متعددة النسيلة. سيتم استخدام CTB لتتبع الخلايا العصبية إلى الوراء من منطقة النواة المتكئة إلى منطقة نيغرا تحتستانتيا. كما يقدم البروتوكول الحالي إرشادات لتعديل بروتوكول iDISCO الأصلي بطريقتين متميزتين: 1) التخفيض الإجمالي لتلطيخ الخلفية عن طريق تغيير الكواشف المصلية في خطوات الحجب ، و 2) توسيع وقت الحضانة ليكون مناسبا لعينات الأنسجة الأكبر. وعموما، يوفر هذا البروتوكول دليلا مستمرا على أن تقنيات إزالة رهاب الماء ممكنة في أنسجة الدماغ للفئران، وليس لها تفاعلات ضارة ملحوظة مع البروتينات الفيروسية HIV-1، وهي متوافقة مع الأجسام المضادة TH، والأجسام المضادة Iba1، وCTB.