Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Diverse tecniche di pulizia dei tessuti sono state convalidate per l’uso nel cervello: idrogel, idrofilo e idrofobo. Queste tecniche mirano a trasformare un tessuto trasparente attraverso la delipidazione, la decolorazione e la decalcificazione attraverso la somministrazione di solventi. Una volta che l’indice di rifrazione del campione di tessuto corrisponde all’indice di rifrazione del mezzo di imaging scelto, è possibile ottenere un’immagine chiara del campione. Le tecniche a base di idrogel, come CLARITY, proteggono le biomolecole nel tessuto collegandole agli idrogel a base di acrilico, che prevengono danni strutturali e perdita di proteine¹. Tuttavia, le tecniche di idrogel utilizzano sostanze chimiche aggressive che hanno il potenziale di danneggiare i tessuti più fragili e campioni di tessuto più densi potrebbero non essere compatibili con il protocollo idrogel. Alcune tecniche di idrogel possono richiedere attrezzature costose o portare all’espansione dei tessuti. Le tecniche idrofile, come CUBIC, preservano la struttura 3D attraverso la formazione di legami idrogeno all’interno del tessuto². L’espansione tissutale può verificarsi anche in alcuni protocolli idrofili. La capacità di compensazione delle tecniche idrofile spesso non corrisponde alla capacità che hanno le tecniche idrofobiche, che è importante per i tessuti più densi e più spessi³.

Le tecniche idrofobiche sono solitamente veloci, non richiedono attrezzature speciali e producono un campione facile da maneggiare e conservare. iDISCO è una tecnica idrofoba che elimina il restringimento che può verificarsi in altri protocolli idrofobici. Originariamente, la tecnica di compensazione dei tessuti iDISCO è stata descritta da Renier et al.⁴ per gli embrioni e gli organi densi e adulti dei topi. Questa tecnica rimuove l’acqua dal tessuto nella fase iniziale di disidratazione, riducendo così la dispersione della luce. Il tessuto viene permeabilizzato durante il pretrattamento per consentire la penetrazione profonda degli anticorpi. I coloranti Alexa Fluor nello spettro rosso lontano sono utilizzati per l’immunolabeling per evitare l’autofluorescenza del tessuto a lunghezze d’onda inferiori⁵. I tessuti che sono stati sottoposti a protocolli di clearing idrofobico sono in grado di essere maneggiati facilmente e possono essere ripresi più volte grazie alla longevità dei coloranti Alexa Fluor. Se conservati correttamente, i tessuti possono fornire immagini per mesi o un anno dopo l’elaborazione iniziale.

Nel presente protocollo, l’anticorpo tirosina idrossilasi (TH), l’anticorpo Iba1 e la subunità B della tossina del colera (CTB) sono stati utilizzati sia sul cervello di ratto maschile che femminile e transgenico HIV-1 (Tg). Il ratto HIV-1 Tg possiede sette dei nove geni che compongono il genoma virale dell’HIV-1, che porta a un modello non infettivo di esposizione a lungo termine alla proteina HIV-1^6,7,8. Alterazioni dopaminergiche sono state precedentemente dimostrate nel ratto HIV-1 Tg e l’HIV-1 stesso è una malattia infiammatoria, quindi la scelta degli anticorpi era rilevante per il disegno sperimentale^9,10,11,12. CTB è un tracciante che si attacca ai neuroni tramite il legame gangliosidico e può essere utilizzato per tracciare proiezioni afferenti nel cervello. La CTB è stata precedentemente utilizzata per studiare le proiezioni dal nucleo accumbens all’area della substantia nigra, due aree del cervello fortemente coinvolte con le vie dopaminergiche^13,14,15.

In questo protocollo, TH servirà come marcatore per la produzione di dopamina e Iba1 segnerà la microglia attivata. L’anticorpo TH utilizzato etichetta selettivamente una singola banda a circa 62 kDa che corrisponde alla tirosina idrossilasi. L’anticorpo Iba1 corrisponde alla sequenza carbossi-terminale Iba1. Entrambi gli anticorpi sono stati allevati nel coniglio ed erano policlonali. La CTB sarà utilizzata per il tracciamento retrogrado dei neuroni dall’area del nucleo accumbens all’area della substantia nigra. L’attuale protocollo offre anche una linea guida per l’adeguamento del protocollo iDISCO originale in due modi distinti: 1) riduzione complessiva della colorazione di fondo modificando i reagenti sierici nelle fasi di blocco e 2) ridimensionamento del tempo di incubazione per essere adatto a campioni di tessuto più grandi. Nel complesso, il presente protocollo fornisce prove continue che le tecniche di clearing idrofobico sono fattibili nei tessuti cerebrali del ratto, non hanno interazioni dannose distinguibili con le proteine virali hiv-1 e sono compatibili con l’anticorpo TH, l’anticorpo Iba1 e il CTB.