Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Várias técnicas de limpeza tecidual foram validadas para uso no cérebro: hidrogel, hidrofílico e hidrofóbico. Essas técnicas visam tornar um tecido transparente através da delipidação, descoloração e decalcificação através da administração de solventes. Uma vez que o índice refrativo da amostra de tecido corresponda ao índice de refração do meio de imagem escolhido, uma imagem clara da amostra pode ser obtida. Técnicas baseadas em hidrogel, como clarity, protegem biomoléculas no tecido ligando-as a hidrogéis à base de acríl, o que evita danos estruturais e perda de proteínas¹. No entanto, as técnicas de hidrogel utilizam produtos químicos severos do que têm o potencial de danificar tecidos mais frágeis, e amostras de tecido mais densas podem não ser compatíveis com o protocolo de hidrogel. Certas técnicas de hidrogel podem exigir equipamentos caros ou levar à expansão do tecido. Técnicas hidrofílicas, como o CUBIC, preservam a estrutura 3D através da formação de ligações de hidrogênio dentro do tecido². A expansão tecidual também pode ocorrer em certo protocolo hidrofílico. A capacidade de compensação das técnicas hidrofílicas muitas vezes não corresponde à capacidade que as técnicas hidrofóbicas têm, o que é importante para tecidos mais densos e grossos³.

Técnicas hidrofóbicas geralmente são rápidas, não requerem equipamentos especiais e produzem uma amostra fácil de manusear e armazenar. IDISCO é uma técnica hidrofóbica que elimina o encolhimento que pode ocorrer em outro protocolo hidrofóbico. Originalmente, a técnica de limpeza de tecidos iDISCO foi descrita por Renier et al.⁴ para os embriões e órgãos adultos densos de camundongos. Esta técnica remove a água do tecido na etapa inicial de desidratação, reduzindo assim a dispersão da luz. O tecido é permeabilizado durante o pré-tratamento para permitir a penetração profunda de anticorpos. Os corantes de fluor alexa no espectro vermelho distante são usados para imunolabeling para evitar a autofluorescência do tecido em comprimentos de onda mais baixos⁵. Tecidos que passaram por protocolos de limpeza hidrofóbica são capazes de ser manuseados facilmente e podem ser imagens várias vezes devido à longevidade dos corantes Alexa Fluor. Se armazenados corretamente, os tecidos podem fornecer imagens por meses a um ano após o processamento inicial.

No presente protocolo, anticorpos tyrosine hydroxylase (TH), anticorpo Iba1 e Subunit B (CTB) de tricô de toxina de cólera e cólera foram usados em cérebros de ratos machos e femininos e transgênicos HIV-1 (Tg). O rato HIV-1 Tg possui sete dos nove genes que compõem o genoma viral hiv-1, o que leva a um modelo não infeccioso de exposição proteica hiv-1 a longo prazo^6,7,8. Alterações dopaminérgicas já foram demonstradas anteriormente no rato HIV-1 Tg, e o próprio HIV-1 é uma doença inflamatória, por isso a escolha do anticorpo foi relevante para o desenho experimental^9,10,11,12. CTB é um rastreador que se liga aos neurônios via ligação ganglioside e pode ser usado para traçar projeções diferentes no cérebro. A CTB tem sido usada anteriormente para estudar projeções do núcleo accumbens até a área de nigra substantia, duas áreas do cérebro fortemente envolvidas com as vias dopaminérgicas^13,14,15.

Neste protocolo, o TH servirá como um marcador para a produção de dopamina, e o Iba1 marcará microglia ativada. O anticorpo TH usado rotula seletivamente uma única banda a aproximadamente 62 kDa que corresponde à hidroxilase de tirasina. O anticorpo Iba1 corresponde à sequência iba1 carboxy-terminal. Ambos os anticorpos foram criados em coelho e eram policlonais. CtB será usado para rastreamento retrógrado de neurônios da área de accumbens do núcleo até a área de nigra substantia. O protocolo atual também oferece uma diretriz para o ajuste do protocolo original iDISCO de duas maneiras distintas: 1) redução geral da coloração de fundo alterando os reagentes de soro nas etapas de bloqueio, e 2) dimensionamento do tempo de incubação para ser adequado para amostras de tecido maiores. No geral, o presente protocolo fornece evidências contínuas de que as técnicas de compensação hidrofóbica são viáveis nos tecidos cerebrais do rato, não têm interações prejudiciais perceptíveis com proteínas virais hiv-1 e são compatíveis com anticorpo TH, anticorpo Iba1 e CTB.