Гидрофобный метод очистки тканей для ткани мозга крыс

Несколько методов очистки тканей были проверены для использования в головном мозге: гидрогелевые, гидрофильные и гидрофобные. Эти методы направлены на то, чтобы сделать ткань прозрачной путем делипидации, обесцвечивания и декальцирования путем введения растворителей. Как только показатель преломления образца ткани соответствует индексу преломления выбранной среды визуализации, может быть получено четкое изображение образца. Методы на основе гидрогеля, такие как CLARITY, защищают биомолекулы в ткани, связывая их с гидрогелями на основе акрилов, что предотвращает структурное повреждение и потерю белков^1. Тем не менее, методы гидрогеля используют агрессивные химические вещества, которые могут повредить более хрупкие ткани, и более плотные образцы тканей могут быть несовместимы с протоколом гидрогеля. Некоторые методы гидрогеля могут потребовать дорогостоящего оборудования или привести к расширению тканей. Гидрофильные методы, такие как CUBIC, сохраняют 3D-структуру путем образования водородных связей внутри^{ткани 2.} Расширение тканей также может происходить в определенном гидрофильном протоколе. Очищающая способность гидрофильных методов часто не соответствует способности, которой обладают гидрофобные методы, что важно для более плотных и толстых тканей^3.

Гидрофобные методы, как правило, быстрые, не требуют специального оборудования и производят образец, который прост в обращении и хранении. iDISCO – это гидрофобный метод, который устраняет усадку, которая может возникнуть в другом гидрофобном протоколе. Первоначально метод очистки тканей iDISCO был описан Renier et al.⁴ для эмбрионов и плотных взрослых органов мышей. Этот метод удаляет воду из ткани на начальной ступени обезвоживания, тем самым уменьшая рассеяние света. Ткань проницаема во время предварительной обработки, чтобы обеспечить глубокое проникновение антител. Красители Alexa Fluor в дальне-красном спектре используются для иммуномаркировки, чтобы избежать автофлуоресценции ткани на более низких длинах волн^5. Ткани, прошедшие гидрофобные протоколы очистки, могут легко обрабатываться и могут быть изображены несколько раз благодаря долговечности красителей Alexa Fluor. При правильном хранении ткани могут предоставлять изображения в течение нескольких месяцев до года после первоначальной обработки.

В настоящем протоколе антитело к тирозингидроксилазе (TH), антитело Iba1 и субъединица токсина холеры B (CTB) использовались как на мужском, так и на женском контроле и трансгенном (Tg) мозге крыс с ВИЧ-1. Крыса ВИЧ-1 Tg обладает семью из девяти генов, составляющих вирусный геном ВИЧ-1, что приводит к неинфекционной модели длительного воздействия белка ВИЧ-1^6,7,8. Дофаминергические изменения ранее были продемонстрированы у крысы с ВИЧ-1 Tg, а сам ПОИВ-ВИЧ-1 является воспалительным заболеванием, поэтому выбор антител был актуален для экспериментальной конструкции^9,10,11,12. CTB – это индикатор, который прикрепляется к нейронам через связывание ганглиозидов и может быть использован для отслеживания афферентных проекций в мозге. CTB ранее использовался для изучения проекций от прилежания ядра к области нигры субстанции, двух областей мозга, сильно связанных с дофаминергическими путями^13,14,15.

В этом протоколе TH будет служить маркером для выработки дофамина, а Iba1 будет маркивать активированную микроглию. Используемое антитело TH избирательно маркирует одну полосу при приблизительно 62 кДа, что соответствует тирозинде гидроксилазе. Антитело Iba1 соответствует карбокси-терминальной последовательности Iba1. Оба антитела были выращенные у кролика и были поликлональными. CTB будет использоваться для ретроградного отслеживания нейронов от области прилежащих ядер до области substantia nigra. Текущий протокол также предлагает руководство по корректировке оригинального протокола iDISCO двумя различными способами: 1) общее уменьшение фонового окрашивания путем изменения реагентов сыворотки на этапах блокировки и 2) масштабирование времени инкубации, чтобы быть пригодным для более крупных образцов тканей. В целом, настоящий протокол предоставляет постоянные доказательства того, что методы гидрофобной очистки возможны в тканях мозга крысы, не имеют заметных вредных взаимодействий с вирусными белками ВИЧ-1 и совместимы с антителами TH, антителами Iba1 и CTB.