Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Verschillende weefselophelderingstechnieken zijn gevalideerd voor gebruik in de hersenen: hydrogel, hydrofiele en hydrofobe. Deze technieken zijn erop gericht om een weefsel transparant te maken door delipidatie, ontkleuring en ontkalking via de toediening van oplosmiddelen. Zodra de brekingsindex van het weefselmonster overeenkomt met de brekingsindex van het gekozen beeldvormingsmedium, kan een duidelijk beeld van het monster worden verkregen. Hydrogel gebaseerde technieken, zoals CLARITY, beveiligen biomoleculen in het weefsel door ze te koppelen aan hydrogels op acrylbasis, die structurele schade en verlies van eiwitten voorkomen¹. Hydrogeltechnieken maken echter gebruik van agressieve chemicaliën dan het potentieel hebben om meer fragiele weefsels te beschadigen, en dichtere weefselmonsters zijn mogelijk niet compatibel met het hydrogelprotocol. Bepaalde hydrogeltechnieken kunnen dure apparatuur vereisen of leiden tot weefselexpansie. Hydrofiele technieken, zoals CUBIC, behouden de 3D-structuur door de vorming van waterstofbindingen in het weefsel². Weefselexpansie kan ook optreden in een bepaald hydrofiel protocol. Het clearingvermogen van hydrofiele technieken komt vaak niet overeen met het vermogen dat hydrofobe technieken hebben, wat belangrijk is voor dichtere en dikkere weefsels³.

Hydrofobe technieken zijn meestal snel, vereisen geen speciale apparatuur en produceren een monster dat gemakkelijk te hanteren en op te slaan is. iDISCO is een hydrofobe techniek die de krimp elimineert die kan optreden in andere hydrofobe protocollen. Oorspronkelijk werd de iDISCO weefselopruimingstechniek beschreven door Renier et al.⁴ voor de embryo’s en dichte, volwassen organen van muizen. Deze techniek verwijdert water uit het weefsel in de eerste uitdrogingsstap, waardoor de lichtverstrooiing wordt verminderd. Weefsel wordt gepermeabiliseerd tijdens de voorbehandeling om diepe antilichaampenetratie mogelijk te maken. Alexa Fluor kleurstoffen in het ver-rode spectrum worden gebruikt voor immunolabeling om autofluorescentie van het weefsel bij lagere golflengten te voorkomen⁵. Weefsel dat hydrofobe clearingprotocollen heeft ondergaan, kan gemakkelijk worden behandeld en kan meerdere keren worden afgebeeld vanwege de levensduur van de Alexa Fluor-kleurstoffen. Indien goed opgeslagen, kunnen weefsels beelden leveren gedurende maanden tot een jaar na de eerste verwerking.

In dit protocol werden tyrosine hydroxylase (TH) antilichamen, Iba1 antilichaam en Cholera Toxin Subunit B (CTB) gebruikt op zowel mannelijke als vrouwelijke controle en HIV-1 transgene (Tg) rattenhersenen. De HIV-1 Tg-rat bezit zeven van de negen genen waaruit het hiv-1 virale genoom bestaat, wat leidt tot een niet-infectieus model van langdurige hiv-1-eiwitblootstelling^6,7,8. Dopaminerge veranderingen zijn eerder aangetoond bij de HIV-1 Tg-rat en HIV-1 zelf is een ontstekingsziekte, dus de antilichaamkeuze was relevant voor het experimentele ontwerp^9,10,11,12. CTB is een tracer die zich via gangliosidebinding aan neuronen hecht en kan worden gebruikt om afferente projecties in de hersenen te traceren. CTB is eerder gebruikt voor het bestuderen van projecties van de nucleus accumbens naar het substantia nigra-gebied , twee gebieden van de hersenen die sterk betrokken zijn bij dopaminerge routes^13,14,15.

In dit protocol zal TH dienen als een marker voor dopamineproductie en Iba1 zal geactiveerde microglia markeren. Het gebruikte TH-antilichaam labelt selectief een enkele band van ongeveer 62 kDa die overeenkomt met tyrosinehydroxylase. Het Iba1-antilichaam komt overeen met de Iba1 carboxy-terminale sequentie. Beide antilichamen werden bij konijnen gekweekt en waren polyklonaal. CTB zal worden gebruikt voor retrograde tracering van neuronen van het nucleus accumbens-gebied naar het substantia nigra-gebied. Het huidige protocol biedt ook een richtlijn voor aanpassing van het oorspronkelijke iDISCO-protocol op twee verschillende manieren: 1) algehele vermindering van de achtergrondkleuring door het veranderen van de serumreagentia in de blokkeringsstappen, en 2) het schalen van de incubatietijd om geschikt te zijn voor grotere weefselmonsters. Over het algemeen levert het huidige protocol voortdurend bewijs dat hydrofobe clearingtechnieken haalbaar zijn in hersenweefsels van de rat, geen waarneembare schadelijke interacties hebben met HIV-1 virale eiwitten en compatibel zijn met TH-antilichamen, Iba1-antilichamen en CTB.