初期ショウジョウバエ胚における免疫組織化学およびRNAのその場分布のためのプロトコル
Summary
ここでは、 ショウジョウバエ 胚タンパク質およびRNAの収集から事前包埋および包埋、免疫染色、およびmRNAin situ ハイブリダイゼーションまでの検出および局在化のためのプロトコールについて記載する。
Abstract
カルシウム誘導カルシウム放出シグナル伝達(CICR)は、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。細胞の増殖およびアポトーシス、発生および老化から、ニューロンシナプス可塑性および再生までのすべての細胞活性は、リアノジン受容体(RyRs)と関連している。カルシウムシグナル伝達の重要性にもかかわらず、初期の発達におけるその機能の正確なメカニズムは不明である。妊娠期間の短い生物として、 ショウジョウバエのメラノガスター の胚は、発生中のCICR関連タンパク質およびその調節因子の分布および局在を調査するための主要な研究対象である。しかし、脂質が豊富な胚とキチンが豊富な絨毛膜のために、その有用性はガラス表面に胚を取り付けることの難しさによって制限される。本研究では、 ショウジョウバエ 胚のスライドへの付着を著しく増強する実用的なプロトコルと、組織化学、免疫組織化学、 およびin-situ ハイブリダイゼーションを成功させるための詳細な方法を紹介します。クロムミョウバンゼラチンスライドコーティング法および胚プレエンベディング法は 、ショウジョウバエ の胚タンパク質およびRNA発現を研究する際の収量を劇的に増加させる。このアプローチを実証するために、ショウ ジョウバエのメラノガスターの初期胚発生中のRyRのよく知られた調節因子であるDmFKBP12/Calstabinを研究した。我々は、 DmFKBP12 を合胞体芽細胞胚葉期の早い段階で同定し、発生中の DmFKBP12 の動的発現パターンを報告した:最初は合胞胚葉に均等に分布したタンパク質として、次いで細胞芽球の期間中に皮質の基底層に予め局在し、その後、初期の胃胞の3gem層期に原始ニューロンおよび消化アーキテクチャに分布する。この分布は、これらの層に由来する重要な器官系、すなわち食道下および食道上神経節、腹側神経系、および筋骨格系においてRyRが果たす重要な役割を説明する可能性がある。
Introduction
カルシウム誘導カルシウム放出シグナル伝達(CICR)は、骨格/平滑筋および心臓血管機能、細胞増殖およびアポトーシス、発達、老化、ニューロンシナプス可塑性、および再生などの多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている1,2,3,4,5,6 .リアノジン受容体(RyRs)およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体(IP3R)は、それらの調節因子プロテインキナーゼA(PKA)、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)、FK506結合タンパク質(FKBP)、カルセクエストリン(CSQ)、トリアジン、およびジュンクチンによって制御されるカルシウムシグナル伝達経路における主要なプレーヤーである1,2,3,4,5,6.これらのタンパク質の異常なヒトの発現および変異は、不整脈7および発癌性増殖などの病理学的生理機能につながる可能性があります8,9。
FKBPは、RyRsによって小胞体網状(ER)からのカルシウム放出を調節する。このプロセスは収縮のメカニズムに不可欠であり、したがって、胚性RyRs1,2とともにカルシウム誘発カルシウム放出を介してミオシン – アクチン収縮によって生成されるすべての機械的運動に関与する。マウスモデルでは、RyR2およびその調節因子FKBP12/カルスタビンの欠如は、胚発生中または出生後早期のいずれかにおいて、常に致死的である10,11,12。FKBP12/カルスタビンノックアウトマウスは、胚発生中に不規則な興奮収縮結合(EC)および脳浮腫を伴う重大な心不全を示す。これは、FKBP12/カルスタビンが心臓と脳の発達の両方にとって重要なRyR2チャネル発現の調節に不可欠な役割を果たすことを示しています10。
RyRが実施したカルシウムスパークは、受精したメダカ卵の受精卵形成期に最初に発見されました13,14。しかし、初期胚発生におけるカルシウムシグナル伝達の機能に関する研究はほとんど行われていない。ショウジョウバエのメラノガスターでは、DmFKBP12 S107変異体から得られた結果は、幼虫の発育と健康寿命に対するこの遺伝子の重要性を支持する強力な証拠を提供し、これは酸化ストレスに対するその機能に起因する15,16。最近、ショウジョウバエのメラノガスター発生初期におけるFKBP12/カルスタビンタンパク質とメッセンジャーRNAの動的局在を同定しました17。この方法論に記載されたアプローチを用いて、我々は合胞体芽球(0-2時間)、細胞芽細胞胚葉(2-3時間)、初期ガストルーラ(3-12時間)、および後期ガストルーラ(12-24時間)の間にD.メラノガスターにおけるFKBP12/カルスタビンの発現を追跡することができた。本稿では、古典的なパラフィン切片化のための前胚包埋、胚切片のプレコーティングスライド処理、組織化学染色および免疫染色、遺伝子発現の同定のためのmRNA in-situハイブリダイゼーションなど、以前の研究におけるすべてのアプローチの詳細なプロトコルを提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
RyRsおよびIP3Rs媒介性カルシウムシグナル伝達は、脊椎動物および無脊椎動物の両方の多くの生理学的および病理学的プロセスにおける基本的な経路である1,2,3,4。ヒトでは、RyR2遺伝子におけるCPVT関連R4496C変異などの点変異は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出をもたらし、心機能障害を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(#31771377/31571273/31371256)、国家教育部(#MS2014SXSF038)の外国人特別科学者プログラム、国立教育省中央大学研究基金(#GK201301001/201701005/GERP-17-45)の支援を受け、XZは陝西省教育部の主要プログラム(#2019TS082/2019TS079)の#20JS138の支援を受けています。 陝西省科学技術部自然科学基礎研究プログラム青少年プロジェクト(#2020JQ-885)。
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
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