Протокол иммуногистохимии и распределения РНК in-situ в раннем эмбрионе дрозофилы
Summary
Здесь мы описываем протокол обнаружения и локализации белка и РНК эмбриона дрозофилы от сбора до предварительного встраивания и встраивания, иммуноокрашивания и гибридизации мРНК in situ .
Abstract
Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах. Каждая клеточная активность от пролиферации и апоптоза клеток, развития и старения до нейрональной синаптической пластичности и регенерации была связана с рецепторами рианодина (RyRs). Несмотря на важность передачи сигналов кальция, точный механизм его функции в раннем развитии неясен. Как организм с коротким гестационным периодом, эмбрионы Drosophila melanogaster являются основными объектами исследования для изучения распределения и локализации CICR-ассоциированных белков и их регуляторов в процессе развития. Однако из-за их богатых липидами эмбрионов и богатых хитином хорионов их полезность ограничена сложностью установки эмбрионов на стеклянные поверхности. В этой работе мы представляем практический протокол, который значительно улучшает прикрепление эмбриона дрозофилы к слайдам и детализирует методы для успешной гистохимии, иммуногистохимии и гибридизации in-situ . Метод скользящего покрытия хром-квасцового желатина и метод предварительного встраивания эмбрионов резко увеличивают выход при изучении белка эмбриона дрозофилы и экспрессии РНК. Чтобы продемонстрировать этот подход, мы изучили DmFKBP12/Calstabin, известный регулятор RyR во время раннего эмбрионального развития Drosophila melanogaster. Мы идентифицировали DmFKBP12 еще на стадии синцитиальной бластодермы и сообщили о динамическом паттерне экспрессии DmFKBP12 во время разработки: первоначально как равномерно распределенный белок в синцитиальной бластодерме, затем предварительно локализующийся в цокольном слое коры во время клеточной бластодермы, прежде чем распространяться в примитивной нейрональной архитектуре и архитектуре пищеварения во время фазы трехместного слоя в ранней гаструляции. Это распределение может объяснить решающую роль, которую RyR играет в жизненно важных системах органов, которые происходят из этих слоев: субэзофагеальный и надпищеводный ганглий, вентральная нервная система и опорно-двигательный аппарат.
Introduction
Передача сигналов высвобождения кальция,индуцированная кальцием (CICR), играет решающую роль во многих биологических процессах, таких как скелетная/гладкая мускулатура и сердечная сосудистая функция, пролиферация и апоптоз клеток, развитие, старение, нейрональная синаптическая пластичность и регенерация1,2,3,4,5,6 . Рянодиновые рецепторы (RyRs) и инозитол-1,4,5-трисфосфатные рецепторы (IP3Rs) являются основными игроками в сигнальном пути кальция, контролируемом их регуляторами протеинкиназы A (PKA), Ca2+/кальмодулин-зависимой протеинкиназы II (CaMKII), FK506 связывающих белков (FKBPs), кальциквестрина (CSQ), триадина и юнктина1,2,3,4,5,6 . Аномальная экспрессия человека и мутации в этих белках могут привести к патологической физиологии, такой как аритмии7 и онкогенная пролиферация8,9.
FKBP регулируют высвобождение кальция из эндоплазматической ретикулярной (ER) RyRs. Этот процесс необходим для механизма сокращения и, таким образом, отвечает за все механические движения, генерируемые сокращением миозина-актина посредством высвобождения кальция, вызванного кальцием, вместе с эмбриональными RyRs1,2. В мышиных моделях недостаток RyR2 и его регулятора FKBP12/Calstabin неизменно смертелен либо во время эмбрионального развития, либо в раннем постнатальном периоде10,11,12. Нокаутирующие мыши FKBP12/Calstabin демонстрируют критические пороки сердца с нерегулярной связью возбуждения-сокращения (EC) и отеком мозга во время эмбрионального развития. Это указывает на то, что FKBP12/Calstabin играет важную роль в регулировании экспрессии каналов RyR2, что важно как для сердечного, так и для мозгового развития10.
Полученные RyR искры кальция были первоначально обнаружены в фазе формирования зиготы оплодотворенных яиц медаки13,14. Тем не менее, было проведено мало исследований функции передачи сигналов кальция в раннем эмбриональном развитии. В Drosophila melanogaster результаты, полученные от мутантов DmFKBP12 S107, предоставляют убедительные доказательства, подтверждающие важность этого гена для развития личинок и здоровой продолжительности жизни, что объясняется его функцией против окислительного стресса15,16. Недавно мы выявили динамическую локализацию белка FKBP12/Calstabin и матричной РНК во время раннего развития Drosophila melanogaster17. Используя подходы, описанные в этой методологии, мы смогли отследить экспрессию FKBP12/Calstabin у D. melanogaster во время синцитиальной бластодермы (0-2 ч), клеточной бластодермы (2-3 ч), ранней гаструлы (3-12 ч) и поздней гаструлы (12-24 ч). В этой статье мы представляем подробные протоколы каждого подхода в предыдущем исследовании, включая встраивание преэмбриона для классического парафинового сечения, предварительную обработку слайдов для эмбриональных срезов, гистохимическое окрашивание и иммуноокрашивание, а также гибридизацию мРНК in-situ для идентификации экспрессии генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опосредованная кальциевыми сигналами RyRs и IP3R является фундаментальным путем во многих физиологических и патологических процессах как позвоночных, так и беспозвоночных животных1,2,3,4. У людей точечные мутации, такие ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (#31771377/ 31571273/31371256), Программой иностранных выдающихся ученых от Национального департамента образования (#MS2014SXSF038), Фондом исследований центральных университетов Национального департамента образования (#GK201301001/201701005/GERP-17-45), а XZ поддерживается Фондом выдающихся докторских диссертаций (#2019TS082 /2019TS079), Ключевой программой Департамента образования провинции Шэньси (#20JS138), Молодежный проект Программы фундаментальных исследований в области естественных наук Департамента науки и техники провинции Шэньси (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
- Weisleder, N., Ma, J. Altered Ca2+ sparks in aging skeletal and cardiac muscle. Ageing Research Reviews. 7 (3), 177-188 (2008).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiological Reviews. 88 (4), 1491-1545 (2008).
- Fan, J., et al. Ryanodine Receptors: Functional Structure and Their Regulatory Factors. Chinese Journal of Cell Biology. 37 (1), 6-15 (2015).
- Xu, X., Balk, S. P., Isaacs, W., Ma, J. Calcium signaling: an underlying link between cardiac disease and carcinogenesis. Cell & Bioscience. 8 (39), 1-2 (2018).
- Xu, X., Bhat, M. B., Nishi, M., Takeshima, H., Ma, J. Molecular cloning of cDNA encoding a Drosophila ryanodine receptor and functional studies of the carboxyl-terminal calcium Release Channel. Biophysical Journal. 78 (3), 1270-1281 (2000).
- George, G. K., et al. Comparative analysis of FKBP family protein: evaluation, structure, and function in mammals and Drosophila melanogaster. BMC Developmental Biology. 18 (1), 1-12 (2018).
- Zhou, X., et al. Syncytium calcium signaling and macrophage function in the heart. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Wang, L., et al. Calcium and CaSR/IP3R in prostate cancer development. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-7 (2018).
- Xu, M., Seas, A., Kiyani, M., Ji, K. S., Bell, H. N. A temporal examination of calcium signaling in cancer- from tumorigenesis, to immune evasion, and metastasis. Cell & Bioscience. 8 (1), 1-9 (2018).
- Shou, W., et al. Cardiac defects and altered ryanodine receptor function in mice lacking FKBP12. Nature. 391 (6666), 489-492 (1998).
- Xin, H., et al. Oestrogen protects FKBP12.6 null mice from cardiac hypertrophy. Nature. 416 (6878), 334-337 (2002).
- Zalk, R., et al. Structure of a mammalian ryanodine receptor. Nature. 517 (7532), 44-49 (2015).
- Ridgway, E. B., Gilkey, J. C., Jaffe, L. F. Free calcium increases explosively in activating medaka eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 74 (2), 623-627 (1977).
- Gilkey, J. C., Jaffe, L. F., Ridgway, E. B., Reynolds, G. T. A free calcium wave traverses the activating egg of the medaka, Oryzias latipes. Journal of Cell Biology. 76 (2), 448-466 (1978).
- Kreko-Pierce, T., Azpurua, J., Mahoney, R. E., Eaton, B. A. Extension of health span and life span in Drosophila by S107 requires the calstabin homologue FK506-BP2. Journal of Biological Chemistry. 291 (50), 26045-26055 (2016).
- Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (11), 5942-5947 (2000).
- Feng, R., et al. Dynamics expression of DmFKBP12/Calstabin during embryonic early development of Drosophila melanogaster. Cell & Bioscience. 9 (1), 1-16 (2019).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 633-645 (1958).
- Xu, X., Dong, C., Vogel, B. Hemicentins Assemble on Diverse Epithelia in the Mouse. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (2), 119-126 (2007).
- Wehrens, X. H., et al. FKBP12.6 deficiency and defective calcium release channel (ryanodine receptor) function linked to exercise-induced sudden cardiac death. Cell. 113 (7), 829-840 (2003).
- Wehrens, X. H., et al. Protection from cardiac arrhythmia through ryanodine receptor-stabilizing protein calstabin2. Science. 304 (5668), 292-296 (2004).
- Bellinger, A. M., et al. Remodeling of ryanodine receptor complex causes "leaky" channels: a molecular mechanism for decreased exercise capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (6), 2198-2202 (2008).
- Maruyama, M., et al. FKBP12 is a critical regulator of the heart rhythm and the cardiac voltage-gated sodium current in mice. Circulation Research. 108 (9), 1042-1052 (2011).
- Xu, X., et al. FKBP12 is the only FK506 binding protein mediating T-cell inhibition by the immunosuppressant FK506. Transplantation. 73 (11), 1835-1838 (2002).
- Zalk, R., Marks, A. R. Ca2+ release channels join the ‘resolution revolution’. Trends in Biochemical Sciences. 42 (7), 543-555 (2017).
