Um Protocolo para Imunohistoquímica e Distribuição In-situ de RNA dentro do Embrião Drosophila Precoce
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo de detecção e localização da proteína de embrião Drosophila e RNA da coleta à pré-incorporação e incorporação, imunostaining e mRNA in situ hibridização.
Abstract
A sinalização de liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR) desempenha um papel crítico em muitos processos biológicos. Toda atividade celular desde a proliferação celular e apoptose, desenvolvimento e envelhecimento, até a plasticidade sináptica neuronal e a regeneração têm sido associadas aos receptores ryanodo (RyRs). Apesar da importância da sinalização de cálcio, o mecanismo exato de sua função no desenvolvimento precoce não é claro. Como um organismo com um curto período gestacional, os embriões de Drosophila melanogaster são temas de estudo primordial para investigar a distribuição e localização de proteínas associadas ao CICR e seus reguladores durante o desenvolvimento. No entanto, devido aos seus embriões ricos em lipídios e corão rica em quitina, sua utilidade é limitada pela dificuldade de montar embriões em superfícies de vidro. Neste trabalho, introduzimos um protocolo prático que aumenta significativamente a fixação do embrião Drosophila em slides e métodos de detalhes para histoquímica bem sucedida, imunohistoquímica e hibridização in situ . O método de revestimento de slides de gelatina cromada e o método de pré-incorporação de embriões aumentam drasticamente o rendimento no estudo da proteína embrião Drosophila e da expressão de RNA. Para demonstrar essa abordagem, estudamos o DmFKBP12/Calstabin, um conhecido regulador do RyR durante o desenvolvimento embrionário precoce do Drosophila melanogaster. Identificamos o DmFKBP12 no estágio de blastoderme sinintítico e relatamos o padrão de expressão dinâmica do DmFKBP12 durante o desenvolvimento: inicialmente como uma proteína distribuída uniformemente na blastodermia sincicial, localizando preliminarmente a camada de porão do córtex durante o blastoderm celular, antes de distribuir na arquitetura neuronal e digestão primitiva durante a fase de três gemas no início da gasolação. Essa distribuição pode explicar o papel crítico que o RyR desempenha nos sistemas vitais de órgãos que se originam a partir dessas camadas: o gânglio suboesofágico e supraesofágico, o sistema nervoso ventral e o sistema musculoesquelético.
Introduction
A sinalização de liberação de cálcio (CICR) tem papel crítico em muitos processos biológicos, como músculo esquelético/liso e função vascular cardíaca, proliferação celular e apoptose, desenvolvimento, envelhecimento, plasticidade sináptica neuronal e regeneração1,2,3,4,5,6 . Os receptores ryanodine (RyRs) e os receptores de linfosfato inositol 1,4,5-trisfosfato (IP3Rs) são os principais players na via de sinalização de cálcio controlada por seus reguladores protein quinase A (PKA), Ca2+/calmodulin-dependent protein quinase II (CaMKII), FK506 proteínas vinculantes (FKBPs), calsequestrin (CSQ), tqdinria, tqdinria, tq e junctina1,2,3,4,5,6 . A expressão humana anormal e as mutações nessas proteínas podem levar à fisiologia patológica, como arritmias7 e proliferação oncogênica8,9.
FKBPs regulam a liberação de cálcio do reticular endoplasmico (ER) por RyRs. Este processo é essencial para o mecanismo de contração e, portanto, responsável por todo o movimento mecânico gerado pela contração miosina-actina através da liberação de cálcio induzida pelo cálcio, juntamente com ryRs1,2 embrionário. Nos modelos de mouse, a falta de RyR2 e seu regulador FKBP12/Calstabin é invariavelmente letal, seja durante o desenvolvimento embrionário ou no período pós-natal inicial10,11,12. Os camundongos eliminados FKBP12/Calstabin apresentam defeitos cardíacos críticos com acoplamento irregular de excitação- contração (CE) e edema cerebral durante o desenvolvimento embrionário. Isso indica que o FKBP12/Calstabin desempenha um papel essencial na regulação da expressão do canal RyR2, o que é importante tanto para o desenvolvimento cardíaco quanto cerebral10.
As faíscas de cálcio conduzidas pelo RyR foram inicialmente descobertas na fase de formação de zigotos de ovos Medaka fertilizados13,14. No entanto, poucas investigações foram realizadas sobre a função da sinalização de cálcio no desenvolvimento embrionário precoce. Em Drosophila melanogaster, os resultados obtidos dos mutantes DmFKBP12 S107 fornecem fortes evidências que sustentam a importância desse gene para o desenvolvimento larval e uma vida útil saudável, que é atribuída à sua função contra o estresse oxidativo15,16. Recentemente, identificamos a localização dinâmica da proteína FKBP12/Calstabin e do RNA mensageiro durante o desenvolvimento inicial de Drosophila melanogaster17. Utilizando as abordagens descritas nesta metodologia, pudemos rastrear a expressão de FKBP12/Calstabin em D. melanogaster durante o blastoderm sincicial (0-2 h), blastoderm celular (2-3 h), gastrula precoce (3-12 h) e gastrula tardia (12-24 h). Neste artigo, apresentamos os protocolos detalhados de todas as abordagens do estudo anterior, incluindo incorporação pré-embrionária para secção clássica de parafina, tratamento de slides pré-revestimento para seções embrionárias, coloração de histoquímica e imunostaining, e hibridização mRNA in-situ para identificação da expressão genética.
Protocol
Representative Results
Discussion
RyRs e IP3Rs mediados sinalização de cálcio é um caminho fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos de animais vertebrados e invertebrados1,2,3,4. Em humanos, mutações pontuais, como a mutação R4496C associada ao CPVT, no gene RyR2 levam ao vazamento de cálcio do ritúlumo sarcoplasmático do cardiomiócito, resultando em disfunção cardíaca. Essas mutações aprese…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (#31771377/ 31571273/31371256), o Programa de Cientistas Distintos Estrangeiros do Departamento Nacional de Educação (#MS2014SXSF038), o Fundo Nacional de Pesquisa das Universidades Centrais do Departamento de Educação (#GK201301001 201701005/GERP-17-45) e XZ são apoiados pelo Fundo de Tese de Doutorado Excepcional (#2019TS082/2019TS079), Programa-Chave do Departamento de Educação Provincial de Shaanxi (#20JS138), o Projeto Jovem do Programa de Pesquisa Básica de Ciências Naturais do Departamento provincial de Ciência e Tecnologia de Shaanxi (#2020JQ-885).
Materials
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
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