Summary

Un protocollo per l'immunoistochimica e la distribuzione dell'RNA in situ all'interno dell'embrione di drosofila precoce

Published: May 06, 2022
doi:

Summary

Qui, descriviamo un protocollo per il rilevamento e la localizzazione della proteina embrionale di Drosophila e dell’RNA dalla raccolta al pre-incorporamento e incorporamento, all’immunocolorazione e all’ibridazione in situ dell’mRNA.

Abstract

La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici. Ogni attività cellulare dalla proliferazione cellulare e apoptosi, allo sviluppo e all’invecchiamento, alla plasticità sinaptica neuronale e alla rigenerazione è stata associata ai recettori della rianodina (RyRs). Nonostante l’importanza della segnalazione del calcio, l’esatto meccanismo della sua funzione nello sviluppo iniziale non è chiaro. Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine associate al CICR e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo pratico che migliora significativamente l’attaccamento dell’embrione di Drosophila su vetrini e metodi di dettaglio per il successo dell’istochimica, dell’immunoistochimica e dell’ibridazione in situ . Il metodo di rivestimento del vetrino della gelatina di allume di cromo e il metodo di pre-incorporamento dell’embrione aumentano notevolmente la resa nello studio della proteina embrionale di Drosophila e dell’espressione dell’RNA. Per dimostrare questo approccio, abbiamo studiato DmFKBP12 / Calstabin, un noto regolatore di RyR durante lo sviluppo embrionale precoce di Drosophila melanogaster. Abbiamo identificato DmFKBP12 già nello stadio sinciziale del blastoderma e riportato il modello di espressione dinamica di DmFKBP12 durante lo sviluppo: inizialmente come proteina uniformemente distribuita nel blastoderma sinciziale, quindi localizzando preliminarmente nello strato basale della corteccia durante il blastoderma cellulare, prima di distribuirsi nell’architettura neuronale e digestiva primitiva durante la fase dello strato di tre gemme nella gastrulazione precoce. Questa distribuzione può spiegare il ruolo critico che RyR svolge nei sistemi di organi vitali che hanno origine da questi strati: il ganglio subesofageo e sopraesofageo, il sistema nervoso ventrale e il sistema muscolo-scheletrico.

Introduction

La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici, come la funzione scheletrica/muscolare liscia e la funzione vascolare cardiaca, la proliferazione cellulare e l’apoptosi, lo sviluppo, l’invecchiamento, la plasticità sinaptica neuronale e la rigenerazione1,2,3,4,5,6 . I recettori della rianodina (RyRs) e i recettori dell’inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) sono i principali attori nella via di segnalazione del calcio controllata dai loro regolatori proteina chinasi A (PKA), Ca2+ / calmodulina-dipendente proteina chinasi II (CaMKII), FK506 proteine leganti (FKBPs), calsequestrina (CSQ), triadina e junctin1,2,3,4,5,6 . L’espressione umana anomala e le mutazioni in queste proteine possono portare a fisiologia patologica come aritmie7 e proliferazione oncogenica8,9.

Le FKBP regolano il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico (ER) da parte dei RyR. Questo processo è essenziale per il meccanismo di contrazione, e quindi responsabile di tutti i movimenti meccanici generati dalla contrazione della miosina-actina attraverso il rilascio di calcio indotto dal calcio insieme ai RyR embrionali1,2. Nei modelli murini, la mancanza di RyR2 e del suo regolatore FKBP12/Calstabin è invariabilmente letale, sia durante lo sviluppo embrionale che nel primo periodo postnatale10,11,12. I topi knockout FKBP12/Calstabin presentano difetti cardiaci critici con accoppiamento irregolare eccitazione-contrazione (EC) ed edema cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Ciò indica che FKBP12/Calstabin svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell’espressione del canale RyR2, che è importante sia per lo sviluppo cardiaco che cerebrale10.

Le scintille di calcio condotte da RyR sono state inizialmente scoperte nella fase di formazione dello zigote delle uova medaka fecondate13,14. Tuttavia, poche indagini sono state eseguite sulla funzione della segnalazione del calcio nello sviluppo embrionale precoce. In Drosophila melanogaster, i risultati ottenuti dai mutanti DmFKBP12 S107 forniscono una forte evidenza a sostegno dell’importanza di questo gene per lo sviluppo larvale e una durata di vita sana, che è attribuita alla sua funzione contro lo stress ossidativo15,16. Recentemente, abbiamo identificato la localizzazione dinamica della proteina FKBP12/Calstabin e dell’RNA messaggero durante lo sviluppo precoce di Drosophila melanogaster17. Utilizzando gli approcci descritti in questa metodologia, siamo stati in grado di tracciare l’espressione di FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster durante il blastoderma sinciziale (0-2 h), il blastoderma cellulare (2-3 h), la gastrula precoce (3-12 h) e la gastrula tardiva (12-24 h). In questo articolo, presentiamo i protocolli dettagliati di ogni approccio nello studio precedente, tra cui l’incorporamento pre-embrionale per il sezionamento classico di paraffina, il trattamento con vetrini pre-rivestimento per sezioni embrionali, la colorazione istochimica e l’immunocolorazione e l’ibridazione in situ dell’mRNA per l’identificazione dell’espressione genica.

Protocol

1. Preparazione di piatti di agar di succo d’uva Aggiungere 5 g di agar e 5 g di saccarosio a 150 ml di acqua distillata. Farlo bollire usando un forno a microonde fino a quando l’agar e il saccarosio sono completamente sciolti. Mescolare 50 ml di succo d’uva al 100% e la soluzione insieme. Aggiungere 1 mL di acido propionico al 100% per rendere la concentrazione finale allo 0,5% di acido propionico. Versare 25 ml della soluzione preparata in ogni piastra. Dopo che l’agar si è solidi…

Representative Results

Le figure descrivono i protocolli utilizzati per superare la sfida di attaccare embrioni di Drosophila ad alto contenuto di lipidi e chitina (Tabella 1) alla superficie del vetrino per l’esame e la sperimentazione. Utilizzando il metodo di rivestimento dei vetrini di gelatina di allume cromato mostrato nella Figura 1, abbiamo migliorato l’attaccamento degli embrioni di Drosophila sulla superficie dei vetrini, mentre il metodo di pre-incorporamento dell’embr…

Discussion

La segnalazione del calcio mediata da RyR e IP3R è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati1,2,3,4. Nell’uomo, le mutazioni puntiformi, come la mutazione R4496C associata a CPVT, nel gene RyR2 portano alla fuoriuscita di calcio dal reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, con conseguente disfunzione cardiaca. Queste mutazioni si pr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dal Foreign Distinguished Scientist Program del National Department of Education (#MS2014SXSF038), dal National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) e XZ è supportato da Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), il Natural Science Basic Research Program Youth Project del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia dello Shaanxi (#2020JQ-885).

Materials

-20°C Refrigerator Meiling Biology &Medical DW-YL270 Used for regent storage
-80°C Ultra low temperature refrigerator Thermo Forma 90 Series Used for regent storage
Agar Sigma-Aldrich WXBB6360V Preparation of grape juice agar plates
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Roche 11093274910 For the detection of digoxigenin-labeled compound
Biochemical incubator Shanghai Bluepard Instruments LRH-250 In-situ Hybridization
Bouin's solution Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69945460 Drosophila Embryo Embedding
Centrifuge Eppendorf 540BH07808 In-situ Hybridization
Centrifuge tube Denville C-2170 Drosophila Embryo Collection
Chrome Alum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10001018 Coating Slides
Constant temperature water bath Jintan Henfeng Instruments KW-1000DC Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Dako REAL EnVision Detection System Dako K5007 In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining.
DEPC Sigma-Aldrich D5758 In-situ Hybridization
DIG RNA Labeling Kit Roche 11093274910 RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase
Drosophila melanogaster Bloomington Stock Center BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 The stocks of Drosophila melanogaster mutant
Electric blast drying oven Tianjin Taiste Instruments 101-0AB For coating slides and paraffin embedding
Eosin Sigma-Aldrich 230251 Hematoxylin-Eosin Staining
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 100092680 Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Gelatin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10010328 Coating Slides
Gold chloride Sigma-Aldrich 379948 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Hematoxylin Sigma-Aldrich H3136 Hematoxylin-Eosin Staining
High Pure PCR Product Purification Kit Roche 11732668001 For purification of PCR products
Intelligent constant temperature and humidity box Ningbo Jiangnan Instruments HWS For fly maintenance
LE Agarose HyAgarose 14190108029 Pre-embedding
Methanol Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10014108 Drosophila Embryo Collection
Microscope ZEISS Observer.A1 Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Microscope Slides MeVid Labware Manufacturing P105-2001 Coating Slides
Neutral Gum Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10004160 Hematoxylin-Eosin Staining
N-heptane Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 40026768 Drosophila Embryo Collection
Paraffin slicer Huahai science instrument HH-2508III In-situ Hybridization
Paraffin Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 69019461 Paraffin Embedding
pH/mV Meter Sartorius PB-10 For determing the pH value of a solution
Silver nitrate Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10018461 Periodic Acid-Silver Methenamine Staining
Ultrapure water meter Thermo AFXI-0501-P In-situ Hybridization
Xylene Sinopharm Chemical Reagent at Beijing 10023418 Paraffin Embedding

References

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Zhang, W., Lei, X., Zhou, X., He, B., Xiao, L., Yue, H., Wang, S., Sun, Y., Wu, Y., Wang, L., Ghartey-Kwansah, G., Jones, O. D., Bryant, J. L., Xu, M., Ma, J., Xu, X. A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo. J. Vis. Exp. (183), e61776, doi:10.3791/61776 (2022).

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