Qui, descriviamo un protocollo per il rilevamento e la localizzazione della proteina embrionale di Drosophila e dell’RNA dalla raccolta al pre-incorporamento e incorporamento, all’immunocolorazione e all’ibridazione in situ dell’mRNA.
La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici. Ogni attività cellulare dalla proliferazione cellulare e apoptosi, allo sviluppo e all’invecchiamento, alla plasticità sinaptica neuronale e alla rigenerazione è stata associata ai recettori della rianodina (RyRs). Nonostante l’importanza della segnalazione del calcio, l’esatto meccanismo della sua funzione nello sviluppo iniziale non è chiaro. Come organismo con un breve periodo gestazionale, gli embrioni di Drosophila melanogaster sono soggetti di studio primari per studiare la distribuzione e la localizzazione delle proteine associate al CICR e dei loro regolatori durante lo sviluppo. Tuttavia, a causa dei loro embrioni ricchi di lipidi e del coro ricco di chitina, la loro utilità è limitata dalla difficoltà di montare embrioni su superfici di vetro. In questo lavoro, introduciamo un protocollo pratico che migliora significativamente l’attaccamento dell’embrione di Drosophila su vetrini e metodi di dettaglio per il successo dell’istochimica, dell’immunoistochimica e dell’ibridazione in situ . Il metodo di rivestimento del vetrino della gelatina di allume di cromo e il metodo di pre-incorporamento dell’embrione aumentano notevolmente la resa nello studio della proteina embrionale di Drosophila e dell’espressione dell’RNA. Per dimostrare questo approccio, abbiamo studiato DmFKBP12 / Calstabin, un noto regolatore di RyR durante lo sviluppo embrionale precoce di Drosophila melanogaster. Abbiamo identificato DmFKBP12 già nello stadio sinciziale del blastoderma e riportato il modello di espressione dinamica di DmFKBP12 durante lo sviluppo: inizialmente come proteina uniformemente distribuita nel blastoderma sinciziale, quindi localizzando preliminarmente nello strato basale della corteccia durante il blastoderma cellulare, prima di distribuirsi nell’architettura neuronale e digestiva primitiva durante la fase dello strato di tre gemme nella gastrulazione precoce. Questa distribuzione può spiegare il ruolo critico che RyR svolge nei sistemi di organi vitali che hanno origine da questi strati: il ganglio subesofageo e sopraesofageo, il sistema nervoso ventrale e il sistema muscolo-scheletrico.
La segnalazione del rilascio di calcio indotta dal calcio (CICR) svolge un ruolo fondamentale in molti processi biologici, come la funzione scheletrica/muscolare liscia e la funzione vascolare cardiaca, la proliferazione cellulare e l’apoptosi, lo sviluppo, l’invecchiamento, la plasticità sinaptica neuronale e la rigenerazione1,2,3,4,5,6 . I recettori della rianodina (RyRs) e i recettori dell’inositolo 1,4,5-trisfosfato (IP3R) sono i principali attori nella via di segnalazione del calcio controllata dai loro regolatori proteina chinasi A (PKA), Ca2+ / calmodulina-dipendente proteina chinasi II (CaMKII), FK506 proteine leganti (FKBPs), calsequestrina (CSQ), triadina e junctin1,2,3,4,5,6 . L’espressione umana anomala e le mutazioni in queste proteine possono portare a fisiologia patologica come aritmie7 e proliferazione oncogenica8,9.
Le FKBP regolano il rilascio di calcio dal reticolo endoplasmatico (ER) da parte dei RyR. Questo processo è essenziale per il meccanismo di contrazione, e quindi responsabile di tutti i movimenti meccanici generati dalla contrazione della miosina-actina attraverso il rilascio di calcio indotto dal calcio insieme ai RyR embrionali1,2. Nei modelli murini, la mancanza di RyR2 e del suo regolatore FKBP12/Calstabin è invariabilmente letale, sia durante lo sviluppo embrionale che nel primo periodo postnatale10,11,12. I topi knockout FKBP12/Calstabin presentano difetti cardiaci critici con accoppiamento irregolare eccitazione-contrazione (EC) ed edema cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Ciò indica che FKBP12/Calstabin svolge un ruolo essenziale nella regolazione dell’espressione del canale RyR2, che è importante sia per lo sviluppo cardiaco che cerebrale10.
Le scintille di calcio condotte da RyR sono state inizialmente scoperte nella fase di formazione dello zigote delle uova medaka fecondate13,14. Tuttavia, poche indagini sono state eseguite sulla funzione della segnalazione del calcio nello sviluppo embrionale precoce. In Drosophila melanogaster, i risultati ottenuti dai mutanti DmFKBP12 S107 forniscono una forte evidenza a sostegno dell’importanza di questo gene per lo sviluppo larvale e una durata di vita sana, che è attribuita alla sua funzione contro lo stress ossidativo15,16. Recentemente, abbiamo identificato la localizzazione dinamica della proteina FKBP12/Calstabin e dell’RNA messaggero durante lo sviluppo precoce di Drosophila melanogaster17. Utilizzando gli approcci descritti in questa metodologia, siamo stati in grado di tracciare l’espressione di FKBP12 / Calstabin in D. melanogaster durante il blastoderma sinciziale (0-2 h), il blastoderma cellulare (2-3 h), la gastrula precoce (3-12 h) e la gastrula tardiva (12-24 h). In questo articolo, presentiamo i protocolli dettagliati di ogni approccio nello studio precedente, tra cui l’incorporamento pre-embrionale per il sezionamento classico di paraffina, il trattamento con vetrini pre-rivestimento per sezioni embrionali, la colorazione istochimica e l’immunocolorazione e l’ibridazione in situ dell’mRNA per l’identificazione dell’espressione genica.
La segnalazione del calcio mediata da RyR e IP3R è una via fondamentale in molti processi fisiologici e patologici di animali vertebrati e invertebrati1,2,3,4. Nell’uomo, le mutazioni puntiformi, come la mutazione R4496C associata a CPVT, nel gene RyR2 portano alla fuoriuscita di calcio dal reticolo sarcoplasmatico dei cardiomiociti, con conseguente disfunzione cardiaca. Queste mutazioni si pr…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dal Foreign Distinguished Scientist Program del National Department of Education (#MS2014SXSF038), dal National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) e XZ è supportato da Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), il Natural Science Basic Research Program Youth Project del Dipartimento Provinciale di Scienza e Tecnologia dello Shaanxi (#2020JQ-885).
-20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
-80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |