Propagation of the Microsporidian Parasite <em>Edhazardia aedis</em> in <em>Aedes aegypti</em> Mosquitoes

Anthony Grigsby; Brendan  J. Kelly; Neil  D. Sanscrainte; James  J. Becnel; Sarah  M. Short

doi:10.3791/61574

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

התפשטות הטפיל המיקרו-ספורידיאן אדהאזרדיה אדיס ב-Aedes aegypti יתושים

Published: August 13, 2020

doi:

10.3791/61574

Anthony Grigsby*¹, Brendan J. Kelly*¹, Neil D. Sanscrainte², James J. Becnel², Sarah M. Short¹

¹Department of Entomology,The Ohio State University, ²USDA/ARS Center for Medical, Agricultural, and Veterinary Entomology

Summary

פרוטוקול לתרבות הטפיל המיקרו-ספיורידיאן אדהאזרדיה אדיס. הטפיל הוא מעבר מדור אחד של יתושי Aedes aegypti למשנהו באמצעות העברה אופקית בשלב הזחל ואחריו שידור אנכי בשלב המבוגר. נבגים חיים שורדים לטווח ארוך בביצים נגועות.

Abstract

אדהאזרדיה aedis הוא טפיל מיקרוספרידי של יתושי Aedes aegypti, וקטור מחלה המעביר ארבווירוסים מרובים הגורמים למיליוני מקרי מחלה בכל שנה. א. אדיס גורמת לתמותה וכושר רבייה מופחת בוקטור היתושים ונחקרה בשל הפוטנציאל שלה כסוכן בתחום הביו-תחום. הפרוטוקול שאנו מציגים עבור culturing E. aedis מבוסס על מחזור הזיהום הטבעי שלה, אשר כרוך הן שידור אופקי ואנכי בשלבי חיים שונים של המארח יתוש. יתושי ae. aegypti נחשפים נבגים בשלב הזחל. זחלים נגועים אלה לאחר מכן להבשיל למבוגרים ולשדר את הטפיל אנכית לצאצאיהם. צאצאים נגועים משמשים לאחר מכן כמקור של נבגים להעברה אופקית עתידית. Culturing E. aedis יכול להיות מאתגר לבלתי יזמים בהתחשב במורכבות מחזור החיים של הטפיל, ופרוטוקול זה מספק הדרכה מפורטת וע עזרים חזותיים להבהרה.

Introduction

Aedes aegypti הוא וקטור היתוש של arboviruses מרובים (למשל, דנגה, זיקה, קדחת צהובה) כי יחד מוערכים להסביר מאות מיליוני מקרי מחלה בכל שנה יותר מ 30,000^{מקרי מוות 1,}². טיפול במחלות הנגרמות על ידי פתוגנים אלה מוגבל לטיפול תומך וסביר להניח כי arboviruses נוספים יצוצו^{בעתיד 3}. שליטה של וקטור היתוש הוא ולכן בעל חשיבות עיקרית, כפי שהוא מונע ביעילות שידור של פתוגנים נוכחיים ומתפתחים⁴. באופן מסורתי, אסטרטגיות שליטה וקטורית משתמשות בעיקר בקוטלי חרקים כימיים, אך התנגדות לקוטלי חרקים רבים הנפוץ הניעה את הביקוש לשיטות חדשניות של שליטה וקטורית. סוכן פוטנציאלי אחד שנחקר על תכונות החברה הביו-תחום נגד Ae. aegypti הוא הטפיל אדהאזרדיה aedis⁵^,⁶.

א. אדיס (באנגלית: E. aedis)הוא טפיל^{מיקרו-ספרידי של יתושים א-אדיס על ידי קודו.} הפיתוח והרבייה של א. אדיס מורכבים יחסית ומחזור החיים שלה יכול להמשיך במספר^{דרכים 7,}^8,⁹. מחזור התפתחותי נפוץ אחד מתואר לעומק Becnel ואח ‘, 1989⁷ והוא מנוצל עבור הפצת מעבדה (איור 1)⁸. בקצרה, המחזור מתחיל כאשר Ae. aegypti ביצים נגועות אנכית E. aedis בוקעים לתוך זחלים נגועים אשר מפתחים נבגים לא מדוקים בגוף השומן, ובדרך כלל למות כמו זחלים או גלמים. נבגים לא מדוקים ששוחררו מזחלים מתים מזהמים את בית הגידול ונבלעים על ידי זחלים בריאים של א.א. נבגים אלה לנבט בעיקר במערכת העיכול, להדביק רקמת העיכול של הזחלים החשופים, וכתוצאה מכך שידור אופקי. זחלים נגועים אופקית להתפתח למבוגרים (דור הורים) שבו נבגים binucleate נוצרים. בנקבות, נבגים binucleate אלה לפלוש למערכת הרבייה וporoplasm הקשורים שלהם מדביק תאי ביצה מתפתחים. ביצים אלה בוקעות לאחר מכן לתוך זחלים נגועים (דור פילים), וכתוצאה מכך שידור אנכי של הטפיל והמשך המחזור כמתואר לעיל.

מחקרים רבים חקרו את הפוטנציאל של E. aedis עבור biocontrol. זיהום עם E. aedis הוכח לגרום לירידה ביכולת הרבייה של Ae. aegypti ^{נקבות 10}. יתר על כן, בניסוי חצי שדה, שחרור בלתי צפוי של E. aedis הביא להכחדה מוחלטת של מבחן Ae. aegypti האוכלוסייה נשמר בתוך מארז^{מוקרן 6.} בעוד מסוגל לעבור כמה שלבים של פיתוח ב קבוצה מגוונת של מינים יתושים, E. aedis מועבר רק אנכית Ae. aegypti, המציין רמה גבוהה של^{ספציפיות מארח 11,}¹². כמו כן, בהערכת מעבדה של הסיכון הסביבתי הפוטנציאלי הקשור לאדיס, הטפיל המיקרו-ספרידי לא הצליח להדביק בעלי חיים ימיים שאינם מטרה, כולל טורפים ים נבלעו Ae. aegypti זחלים נגועים E. aedis¹³. תוצאות אלה מדגישות את הפוטנציאל של E. aedis לשמש באסטרטגיות בקרה ביולוגית מיקוד טבעי Ae. aegypti אוכלוסיות.

למרות העובדה כי E. aedis מראה הבטחה לשימוש בשליטה וקטורית, יש אתגרים culturing ופריסה זה בקנה מידה רחב. E. הנבגים אדיס לאבד זיהומים בפחות מיום אחד בטמפרטורות קרות (כלומר, 5 מעלות צלזיוס). גם בטמפרטורות חמות יותר (כלומר, 25 °C), נבגים מאבדים במהירות זיהומים במהלך שלושה^{שבועות 14}. בנוסף, E. aedis חייב להיות תרבותי חיים Ae. יתושים aegypti מינון מבוקר של יתושי זחל בריאים יש צורך להבטיח את השלמת מחזור החיים כדי למנוע קריסה של האוכלוסייה המשמשת לתרבות⁸. הדרישה של vivo culturing מציבה אתגר; עם זאת, ההתקדמות האחרונה בהתרודות מסת יתושים ורובוטיקה (למשל, מסארו ואח’¹⁵⁾יכולה לאפשר דור בקנה מידה גדול של נבגים אדיס. אנו צופים כי הדמיה של מתודולוגיה זו תגביר את הנגישות לפרוטוקול גידול E. aedis ותאפשר לחוקרים נוספים לחקור את הביולוגיה הבסיסית ואת הפוטנציאל המיושם של מערכת זו. כמו כן, אנו צופים כי היא תקל על שיתופי פעולה מוגברים עם מהנדסים, רובוטיקה, ומגזר הטכנולוגיה הרחב יותר, אשר עשוי לשמש לשיפור גידול המוני של E. aedis.

איור 1: א. אדיס התפשטות ב Ae. aegypti. ההתפשטות של א. אדיס מתחילה בביצים נגועות בקעה של א. אדיס. הזחלים הנגועים גדלים^{ל-4 אינסטאר,} נבגים של אדיס מבודדים מהזחלים האלה, ונבגים משמשים להדבקה דרך-דרךית בזחלים בריאים של 2/3^{rd instar} שנוגדו ממצמד לא נגוע של ביצים (שידור אופקי). זחלים אלה נגועים דרך הדם לאחר מכן גדלים לבגרות (דור הורים) ולהטיל ביצים נגועות E. aedis (שידור אנכי). ביצים נגועות (דור פילים) בקעו לאחר מכן כדי להמשיך את מחזור הזיהום ותרבות הטפילים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Protocol

1. יום 0 הצוהר Ae. aegypti ביצים נגוע E. aedis על ידי הצבת מגש גידול זחל עם 1 L deionized (DI) מים. מוסיפים 50 מ”ג מזון דגים.הערה: בזמן הפרסום, זן מעבדה של E. aedis זמין רק ממעבדות לחקור באופן פעיל את הטפיל, כמו E. aedis אינו מרוצה אחסון לטווח ארוך וביצים נגועות אינם מאוחסנים כיום במאגרים. חוקרים המעוניינים לעבוד עם E. aedis יכולים ליצור קשר עם המחבר המתאים כדי לבקש ביצים נגועות.הערה: בקיעת מספר גדול של ביצים נגועות בדרך כלל אינה הכרחית; עשרה E. aedis נגוע Ae. זחלי aegypti מספיקים כדי ≥ 1000 זחלים בריאים.הערה: עבור כל חלקי פרוטוקול זה, איכלנו יתושים בתנאים הבאים: 14 שעות/10 שעות אור / מחזור כהה, טמפרטורה של 27 °C ו-80% לחות יחסית. 2. יום 1 לאחר הבקיעה, להפחית את צפיפות הזחלים ~ 100 זחלים לכל מגש, ביצוע מגשים חדשים לפי הצורך (גם עם 1 L DI מים). מוסיפים חתיכת מזון חתולים יבש לכל מגש. לחדש את המזון כאשר מרוקן, אבל לא לספק עודף של מזון. חתיכה אחת של מזון חתולים (כ 200 מ”ג) כל שלושה ימים מספיקה.הערה: התאם את כמות המזון בהתאם לתנאי הגידול הספציפיים (כלומר, להפחית מזון אם מים הופכים סוערים או זחלים מתים, להגדיל את המזון אם זחלים מתעכבים קשות בפיתוח). ניתן להשתמש במשטרי האכלה אחרים ו/או בתנאי גידול אחרים מאלה המוצעים כאן, אך ייתכן שיהיה צורך בהתאמות לתזמון של פרוטוקול סטנדרטי זה. 3. ימים 4\u20125 כאשר זחלים נגועים הם 3rd –4 instars, בוקעים בריא / נגוע Ae. aegypti ביצים במגש חדש. מאחור בצפיפות כזו בריא Ae. aegypti להגיע 2- 3rd instar ב 48-72 שעות. בידיים שלנו, זה יכול להיות מושגת באמצעות צפיפויות של 200\u2012300 זחלים לכל 1 L של מים עם גישה למזון אד libitum. בקיעת אצוות של ביצים בריאות על פני מספר ימים יכול להבטיח כי זחלים נמצאים בשלב הנכון בעת הצורך. 4. ימים 7\u20128: שידור אופקי הערה: מנון של זחלים בריאים עם E. aedis לא ניתן לבצע עד נבגים לא מדוקים הם במספרים גבוהים בזחלים נגועים (1 x 104 – 1 x 106 לכל זחל). מצב זה מתרחש בשלב 4אינסטאר (איור 2). קציר וכמת נבגים לא מרוקנים. השתמש פיפטה העברה (ייתכן שיהיה יהיה להם לחתוך את הקצה לקוטר רחב יותר) כדי להעביר 10 זחלים נגועים לצינור microcentrifuge 1.5 מ”ל. הסר מי רבייה עם צינור העברה ולשטוף פעם אחת על ידי הוספת ~ 1 מ”ל של מים DI נקיים. הסר את מי השטיפה עם צינור, להוסיף 500 μL של מי DI נקיים 10 זחלים, ו homogenize באמצעות הומוגניזר עלי ומכאני. לכמת נבגים באמצעות hemocytometer בהגדלה 400x.הערה: נבגים לא מדוקים ניתנים לזהות על-ידי צורת הפיריפורם הייחודית שלהם (כלומר, צורת אגס; איור 2א). מינון בריא Ae. aegypti זחלים עם E. אדיס. להכין מזון זחל טרי slurry על ידי ערבוב 1.2 גרם של אבקת כבד, 0.8 גרם שמרים של מבשלת בירה 100 מ”ל של מים.הערה: מזון לא צריך להיות טרי אם הוא משועבד אוטומטית ומאוחסן ב- 4 °C עד לשימוש. להעביר 100 2nd – 3rd instar בריא Ae. aegypti זחלים לתוך 150 מ”ל כוסות או כוסות דגימה. מינון כל 100 זחלים עם 5 x 104 – 1 x 105 נבגים. להוסיף 2 מ”ל של זחל מזון slurry ומי DI לנפח הסופי של 100 מ”ל. לאחר 12-24 שעות של חשיפה, מעבירים זחלים חשופים למגשי גידול ואחורית לבגרות בעקבות פרוטוקול גידולסטנדרטי 16. 5. ניטור והעבר אנכי לפקח על זחלים מנונים עבור גורים ולהעביר גלמים כפי שהם מתפתחים לגביע התגלות בכלוב. סוכר להאכיל מבוגרים אד libitum (לפי16,17). מבוגרים נדבקו על ידי א. אדיס. דם להאכיל מבוגרים(לפי 16,17)ולאסוף ביצים. שידור אנכי של E. aedis מתרחש בשלב זה.הערה: אם ארוחות דם נוספות מסופקות ברגע שהתווסת, הנקבות יכולות להטיל לפחות מצמד אחד נוסף של ביצים לפני שמבוגרים סובלים (לעתים קרובות פתאומיים) מרמות גבוהות של תמותה. השתמש אלה Ae. aegypti ביצים נגוע E. aedis להמשיך התפשטות החל שלב 1 של פרוטוקול זה.הערה: ניתן לאחסן ביצים למשך 2-3 חודשים בתנאים המתאימים16. נקה את כל החומרים שבאו במגע עם E. aedis עם 10% אקונומיקה ו autoclaving (אם אפשר) כדי למנוע זיהום.

Representative Results

E. aedis נגוע Ae. aegypti ליברפול (LVP1b12)ביצים בקעו כמתואר בפרוטוקול לעיל. בשלב 4instar, סימנים חזותיים של זיהום ניתן לצפות, כולל ציסטות נבוב לבן בכל הגוף השומן של זחלים נגועים (דוגמה של פנוטיפ זה מוצג איור 2B). נבגים לא מדוקים נקטפומזחלי כוכב 4 על ידי homogenizing 10 זחלים ב 500 μL DI מים. נבגים אלה היו pyriform (בצורת אגס) וגלוי ב 400x (איור 2A). באמצעות מד המוצית, מחושב ספירת נבגים של 4.05 x10 3 נבגים/μL. מאה בריא Ae. aegypti זחלים היו אז נגועים אופקית עם ~ 50,000 נבגים ב 100 מ”ל מים למנה הסופית של ~ 500 נבגים / זחלים. זחלים גדלו לבגרות (דור הורים) ודם ניזון באמצעות דם ארנב דפיברין בתוספת 1% (v/v) 100 mM אדנוזין טריפוספט. ביצים נגועות אנכית נאספו (דור פילים) ובקעו כדי להמשיך את ההתפשטות של א. אדיס ולכימת את הצלחת הזיהום. בשבעה ימים לאחר הבקיעה, 25 זחלי דור filial הועברו לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מ”ל ונשטפו פעם אחת עם מי DI. זחלים בודדים היו homogenized ב 250 μL של מים DI ומצב זיהום וE. aedis המון הוערכו באמצעות המוציטומטר. שיעור הזיהום האנכי של E. aedis בדור filial נמצא 96% ועומס נזל ממוצע של נדבקים בשבעה ימים לאחר הבקיעה היה 3.31 x 105 (טווח: 3.25 x 104 – 1.47 x 106; איור 3). איור 2: הדמיה של זיהום אדיס Ae. יתושים aegypti. (א) אדיס נבגים פיריפורם לא מדוקים. עשרה E. aedis נגוע 4זחלים instar היו homogenized ב 500 μL של מי DI כשבעה ימים לאחר הבקיעה. 10 μL של הומוגנט הועמס על מד המוציט ונצפה ב 400X. חצים אדומים מצביעים על נבגים של א. אדיס לא מדוקים. (ב) E. aedis נגוע 4זחלים instar לפתח ציסטות נבוב לבן ייחודי בכל הגוף השומן שלהם18. הם גם בדרך כלל יש מפוצלי בטן מעוותים ומנוים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: פרוטוקול תרבות מוביל לזיהום יעיל של א.אדיס בדור הפילי. Ae. aegypti זחלים (n = 25) מדור filial היו homogenized בנפרד 250 μL DI מים 10 μL של הומוגנט הועמסו על המוציטומטר. נוכחות של נבגים לא מדוקדקים הצביעה על זיהום חיובי ונבגים היו מכמתים עבור כל הדגימות החיוביות. (א)שכיחות של זיהום בקרב זחלי פיל. גריי מתאימה לזחלים לא נגועים, ושחור לנגוע. מספרים המוצגים בכל מקטע נותנים את הספירה המוחלטת של אנשים בכל קבוצה. (ב)עומס נבוב עבור כל אדם נגוע. נקודות שחורות מייצגות אתיומן הרישום 10 שהפך לספירת נבובים לא-תכלית עבור כל זחל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

אנו מציגים כאן את השיטה המתוארת במקור בהמברי וריאן, 1982⁸ לגידול E. aedis microsporidia ב Ae. יתושים aegypti. הזן של E. aedis בשימוש במחקר זה נגזר אוסף השדה המקורי על ידי סטיבן Hembree בתאילנד ב 1979¹⁹. השיטה מנצלת את השידור האופקי, המתרחש באופן טבעי במחזור השידור של E. aedis7, כדי^להפיץאת הטפיל באופן מבוקר. שיטה זו יכולה להיות מאתגרת למצטרפים חדשים שאינם מכירים את מראה נבוב, סימפטומים של זיהום בזחלים, או הקואורדינציה הנדרשת כדי להשלים בהצלחה את פרוטוקול גידול מרובה שלמים / מנון. התקווה שלנו היא כי עזרים חזותיים המלווים פרוטוקול זה יפחיתו את המחסומים לכניסה עבור חוקרים המעוניינים תרבות E. aedis.

הפצנו את א. אדיס ב-Ae. aegypti כמתואר לעיל וכמתנו את הצלחת הטפיליזם בדור הפילי. בקצרה, בקענו את ביצי א.א. לאחר מכן הדבקנו אופקית זחלים בריאים עם נבגים אלה באמצעות בליעה אוראלית, וטיפסנו את הזחלים הנגועים אופקית לבגרות. האכלתי את המבוגרים הנגועים (דור ההורים) ואספנו ביצים (דור פילים), שהשערנו שנדבקנו אנכית לטפיל אי אדיס. בקענו ביצים מדור הפיליאל, אספנו והגנו תת-קבוצה של הזחלים^כשהם היו 4 כוכבים. כימתנו את אחוז הזחלים שנדבקו באדיס ואת ספירת נבובי הדם הכוללת בכל הנדבקים. מצאנו כי הרוב המכריע (96%) של אנשים נדבקו ועומס נבט ממוצע של זחלים נגועים היה ~ 10⁵. אנו מסיקים כי פרוטוקול ההתעדורות שלנו הביא להפצה מוצלחת ביותר של E. aedis ב Ae. יתושים aegypti.

ישנם היבטים מרובים של פרוטוקול זה שעשויים להיות מאתגרים במיוחד עבור המשתמש הלא-נכון. אנו מציעים להלן מידע נוסף שעשוי להיות של סיוע. לשאלות לגבי גידול יתושים כללי, מדריך מלא Ae. aegypti תחזוקת מושבה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה. עם זאת, שאלות נפוצות רבות ניתן לטפל על ידי משאבים ממאגר משאבי מחקר זיהומים ביו-הגנה וזיהומים^{מתעוררים 16}, 17^כוללבקיעת^{ביצים, צרכים} תזונתיים כלליים, דיור ותנאים סביבתיים, והאכלה בדם. לגבי ציר הזמן של זיהום, זחלים בקעו מביצים נגועות לא מראים סימנים של זיהום עד מאוחר בשלב⁴ instar. נבגים לא מדוקים מופיעים במהירות, במהלך 1-2 ימים. זחלים עשויים להיראות כמעט לא נגועים ב6 ימים לאחר הבקיעה אבל נגוע מאוד ביום 7 או 8 לאחר הבקיעה. בנוסף, זה יכול להיות מאתגר לדמיין נבגים בדגימות הומוגניות כי ישנם חיידקים רבים אחרים נוכחים הומוגניטים יתושים שלמים, כולל אורגניזמים חד-תאיים אאוקריוטיים אחרים (למשל, שמרים) בגודל דומה כמו E. aedis נבגים לא מופקרים. הצורה הייחודית של נבגים E. aedis (איור 2A)היא שיטה אמינה מאוד לזיהוי ותעזור להבדיל E. aedis מחיידקים אחרים בהומוגנאט. למרות שאין צורך בזיהוי או כימות, אם טיהור נבגים רצוי, זה יכול להיות מושגת באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות סיליקה colloidal אשר יאפשר הפרדה של E. aedis נבגים מאלמנטים מזהמים אחרים בהומוגנאט. תהליך זה מתואר בפירוט בסולטר ואח’^20.

טמפרטורה ותזונה המשמשים בשיטות גידול שונות בדרך כלל בין מעבדות, אבל וריאציות סביר עדיין להניב התפשטות טפיל מוצלח. הבדלים קלים בסוג המזון זחל אינם מפריעים זיהום מוצלח, למרות שאנחנו לא במפורש לבדוק סוגי מזון שונים בפרוטוקול זה. השפעת הטמפרטורה על זיהום נבדקה וזיהום E. aedis נמצא חזק במגוון רחב של טמפרטורות²¹. ייצור נבובים מרבי התרחש ב 30.8 ° C אבל עדיין היה חזק בטמפרטורות גידול נמוך כמו 20 מעלות צלזיוס. ספירת נבובים הופחתה באופן דרמטי בטמפרטורות גידול גבוהות יותר (36 °C), ולכן יש להימנע מטמפרטורות אלה עבור פרוטוקול זה.

זיהום הוא תמיד דאגה בעת עבודה עם טפילים. א. אדיס הוא טפיל מוצלח של Ae. aegypti ולכן יש לשמור בנפרד ממושבות מעבדה נגועות כדי למנוע זיהום. אנו ממליצים על אחסון יתושים נגועים באינקובטור נפרד במידת האפשר. כמו כן, המלצנו כי חומרים המשמשים לעבודת מיקרוספרודיה (למשל, מגשי זחל, צינורות העברה, כלובים, כוסות איסוף ביצים) מיועדים לעבודת מיקרוספרידיה ולא בשימוש רחב יותר לאורך כל החרקים. כל חומרי גידול צריך להיות עיקור עם 10% אקונומיקה לאחר השימוש autoclaving יכול לשמש כדי להשלים חיטוי אקונומיקה.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לספנסר בלנקנשיפ על העזרה בהתנודות יתושים. אנו מודים גם לג’יימס נ. ראדל ומ. דומיניק מגיסטראדו על המשוב המועיל על כתב היד.

Materials

120 mL Specimen cup	McKesson	911759	Inexpensive alternative to beaker
150 mL beakers	VWR	10754-950	For larval dosing
2 oz round glass bottle	VWR	10862-502	Bottle for 10% sucrose in adult cages
3 oz. emergence cup	Henry-Schein	1201502	For transfer of pupae to cage
Adult mosquito cages	Bioquip	1462 or 1450ASV	For adult housing
Autoclave			For sterilization
Bleach			For sterilization
Brewer’s yeast	Solgar		For feeding larvae during dosing
Controlled rearing chamber	Tritech	DT2-MP-47L	Inexpensive small rearing chamber
Cotton roll	VWR	470161-446	Wick for sugar bottles
Defibrinated rabbit blood	Fisher	50863762	For blood feeding adults
Disodium ATP, crystalline	Sigma-Aldrich	A26209-5G	For blood feeding adults
Dry cat food	9Lives	Indoor Complete	For general larval rearing
Fish food flakes	TetraMin		For general larval rearing
Hemocytometer	Fisher	267110	For counting spores
Homogenizer/mixer motor	VWR	47747-370	For homogenizing infected larvae
Larval rearing trays	Sterillite	1961	Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4"
Liver powder	NOW foods	2450	For feeding larvae during dosing
Pipette 1 – 10µL	VWR	89079-962	For larval dosing
Pipette 100 – 1000µL	VWR	89079-974	For food during larval dosing
Pipette tips 1 – 10µL	VWR	10017-042	For larval dosing
Pipette tips 100 – 1000µL	VWR	10017-048	For food during larval dosing
Plastic pestles	VWR	89093-446	For homogenizing infected larvae
Sucrose, crystalline	Life Technologies	15503022	For adult feeding
Transfer pipet	VWR	414004-033	For larval transfer, must trim ends

References

Yellow fever. World Health Organization Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever (2019)
Dengue and severe dengue. World Health Organization Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020)
Weaver, S. C. Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community. Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).
Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).
Becnel, J. J. Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , 20-24 (1990).
Becnel, J. J., Johnson, M. A. Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).
Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).
Hembree, S. C., Ryan, J. R. Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand. Mosquito News. 42, 49-54 (1982).
Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).
Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).
Becnel, J. J., Johnson, M. A. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).
Andreadis, T. G. Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).
Becnel, J. J. Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms. Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).
Undeen, A. H., Becnel, J. J. Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores. Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).
Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. Automated mass rearing system for insect larvae. , (2018).
Methods in Aedes Research. BEI Resources Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf (2016)
Methods in Anopheles Research. BEI Resources Available from: https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf (2014)
Desjardins, C. A., et al. Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes. Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).
Hembree, S. C. Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand. Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).
Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 329-371 (2012).
Becnel, J. J., Undeen, A. H. Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes. J. Vis. Exp. (162), e61574, doi:10.3791/61574 (2020).

Automatically Generated