انتشار الطفيلي Microsporidian Edhazardia aedis في Aedes aegypti البعوض
Summary
بروتوكول لثقافة الطفيلي microsporidian Edhazardia aedis. يتم تمرير الطفيلي من جيل واحد من بعوض Aedes aegypti إلى التالي عن طريق النقل الأفقي في مرحلة اليرقات يليه انتقال عمودي في مرحلة البالغين. يعيش sporoplasms البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في البيض المصاب.
Abstract
Edhazardia aedis هو طفيلي microsporidian من البعوض Aedes aegypti ، وهو ناقل للمرض الذي ينقل الفيروسات الأربو متعددة التي تسبب الملايين من حالات المرض كل عام. هاء aedis يسبب الوفيات وانخفاض اللياقة الإنجابية في البعوض الناقل وقد تم استكشاف إمكاناته كعامل المكافحة البيولوجية. ويستند البروتوكول الذي نقدمه لأصناف E. aedis على دورة العدوى الطبيعية، والتي تنطوي على كل من انتقال أفقي ورأسي في مراحل حياة مختلفة من مضيف البعوض. Ae. يتعرض البعوض aegypti إلى الجراثيم في مرحلة اليرقات. ثم تنضج هذه اليرقات المصابة إلى البالغين وتنقل الطفيليات عمودياً إلى ذريتها. ثم يتم استخدام النسل المصاب كمصدر للغواغة في المستقبل انتقال أفقي. يمكن أن يكون زراعة E. aedis تحديًا للمستهلين نظرًا لتعقيدات دورة حياة الطفيلي ، ويوفر هذا البروتوكول إرشادات مفصلة ومساعدات بصرية للتوضيح.
Introduction
Aedes aegypti هو البعوض الناقل من الفيروسات الأربو متعددة (على سبيل المثال، حمى الضنك، زيكا، والحمى الصفراء) التي تقدر معا أن تمثل مئات الملايين من حالات المرض كل عام وأكثر من 30،000 حالة وفاة1،2. يقتصر علاج الأمراض الناجمة عن هذه العوامل المسببة للأمراض على الرعاية الداعمة ومن المرجح أن تظهر فيروسات أربو إضافية في المستقبل3. ولذلك فإن مكافحة البعوض الناقل له أهمية أساسية، لأنه يمنع بفعالية انتقال مسببات الأمراض الحالية والناشئة4. 20- تستخدم استراتيجيات مكافحة ناقلات الأمراض، تقليدياً، مبيدات الحشرات الكيميائية في المقام الأول، ولكن مقاومة العديد من مبيدات الحشرات الشائعة الاستخدام قد دفعت الطلب على الطرق الجديدة لمكافحة ناقلات الأمراض. أحد عوامل المحتملة التي تم استكشافها لخصائصها المكافحة البيولوجية ضد Ae. aegypti هو الطفيلي Edhazardia aedis5,6.
E. aedis، التي تم تحديدها لأول مرة باسم aedis Nosema بواسطة كودو في عام 1930 ، هو طفيلي microsporidian من Ae. aegypti البعوض7. تطوير وإعادة إنتاج e. aedis معقدة نسبيا ودورة حياتها يمكن أن تمضي في طرق متعددة7,8,9. ويرد وصف دورة تنموية مشتركة واحدة في العمق في Becnel وآخرون، 19897 وتستخدم للنشر المختبري (الشكل 1)8. باختصار ، تبدأ الدورة عندما Ae. بيض aegypti المصاب عموديًا بـ E. aedis يفقس إلى يرقات مصابة تتطور جراثيم أحادية النوى في الجسم الدهني ، وعادة ما تموت كيرقات أو خراء. الجراثيم أحادية النوى المنبعثة من اليرقات الميتة تلوث الموئل ويتم تناولها من قبل يرقات Ae. تنبت هذه الجراثيم في المقام الأول في الجهاز الهضمي ، وتصيب الأنسجة الهضمية من اليرقات المكشوفة ، مما يؤدي إلى انتقال أفقي. تتطور اليرقات المصابة أفقيا إلى البالغين (جيل الوالدين) حيث تتشكل جراثيم binucleate. في الإناث ، تغزو هذه الجراثيم البنوكلية الجهاز التناسلي وتصيب sporoplasm المرتبطة بها خلايا البيض النامية. ثم تفقس هذه البويضات إلى يرقات مصابة (جيل البنوة)، مما يؤدي إلى انتقال عمودي للطفيلي واستمرار الدورة كما هو موضح أعلاه.
وقد بحثت دراسات متعددة في إمكانات E. aedis لضوابط بيولوجية. وقد ثبت الإصابة مع E. aedis أن يؤدي إلى انخفاض القدرة الإنجابية للإناث aegypti 10. وعلاوة على ذلك، في تجربة شبه ميدانية، أدى الافراج الغمري من E. aedis إلى القضاء التام على اختبار Ae. aegypti السكان أبقى داخل الضميمةفحص 6. في حين أن قادرة على الخضوع لبعض مراحل التنمية في مجموعة متنوعة من أنواع البعوض، E. aedis ينتقل فقط عموديا في Ae. aegypti،مما يدل على درجة عالية من خصوصية المضيف11،12. وبالمثل، في تقييم مختبري للمخاطر البيئية المحتملة المرتبطة E. aedis، فشل طفيلي المجهر البورديوديان في إصابة الحيوانات المائية غير المستهدفة ، بما في ذلك الحيوانات المفترسة التي ابتلعت يرقات aegypti المصابة بـ E. aedis13. وتبرز هذه النتائج إمكانية استخدام E. aedis في استراتيجيات المكافحة البيولوجية التي تستهدف مجموعات Ae. aegypti الطبيعية.
على الرغم من حقيقة أن E. aedis يظهر وعدا للاستخدام في مكافحة ناقلات الأمراض، وهناك تحديات لمعالجة ونشرها على نطاق واسع. E. جراثيم aedis تفقد العدوى في أقل من يوم واحد في درجات الحرارة الباردة (أي 5 درجة مئوية). حتى في درجات الحرارة الأكثر دفئا (أي 25 درجة مئوية)، الجراثيم تفقد بسرعة العدوى على مدى ثلاثة أسابيع14. بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون مثقفة E. aedis في Ae. aegypti البعوض والكمية الخاضعة للرقابة من البعوض اليرقات صحية أمر ضروري لضمان الانتهاء من دورة الحياة ومنع انهيار السكان المستخدمة في الثقافة8. إن شرط زراعة الاستزراع في الجسم الحي يمثل تحدياً؛ ومع ذلك، فإن التقدم الذي تحقق مؤخراً في تربية البعوض وتربية الحيوانات الروبوتية (مثل ماسارو وآخرون15)قد يسمح بتوليد واسع النطاق من جراثيم الإهاء. ونحن نتوقع أن التصور لهذه المنهجية سيزيد من إمكانية الوصول إلى E. aedis تربية البروتوكول والسماح لمزيد من الباحثين للتحقيق في البيولوجيا الأساسية والإمكانات التطبيقية لهذا النظام. كما نتوقع أن يسهل ذلك زيادة التعاون مع المهندسين، والروبوطيين، وقطاع التكنولوجيا الأوسع، والذي قد يعمل على تحسين تربية الـ E. aedis.
الشكل 1: E. aedis نشر في Ae. aegypti. انتشار E. aedis يبدأ مع تفريخ E. aedis البيض المصابة. يتم تربية اليرقات المصابة إلى 4إنستار ، يتم عزل جراثيم aedis عن تلك اليرقات ، وتستخدم الجراثيم لتصيب صحية2nd/ 3rd يرقات النجوم التي تربى من مخلب غير مصاب من البيض (انتقال أفقي). ثم يتم تربية هذه اليرقات المصابة عن طريق الفم إلى مرحلة البلوغ (جيل الوالدين) ووضع البيض المصاب بـ E. aedis (انتقال عمودي). ثم يتم تفقيس البيض المصاب (جيل البنوية) لمواصلة دورة العدوى وثقافة الطفيليات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
نقدم هنا الطريقة الموصوفة أصلا في هيمبري وريان، 19828 لتربية E. aedis microsporidia في Ae. aegypti البعوض. وقد استمدت سلالة من e. aedis المستخدمة في هذه الدراسة من مجموعة الحقل الأصلي من قبل ستيفن هيمبري في تايلاند في 197919. تستفيد الطريقة من الإرسال الأفقي ، والذي يحدث بشكل طبيعي في دورة انتقال E. aedis7، لنشر الطفيلي بطريقة خاضعة للرقابة. يمكن أن تكون هذه الطريقة صعبة للقادمين الجدد الذين ليسوا على دراية بمظهر البوغ ، أو أعراض العدوى في اليرقات ، أو التنسيق المطلوب لإكمال بروتوكول التربية /الزُلَم متعدد المراحل بنجاح. نأمل أن المساعدات البصرية التي تصاحب هذا البروتوكول سوف تقلل من الحواجز أمام دخول الباحثين الذين يرغبون في الثقافة E. aedis.
نشرنا E. aedis في Ae. aegypti كما هو موضح أعلاه وكميا نجاح الطفيلية في جيل البنوي. باختصار ، فقسنا E. aedis المصابة Ae. بيض aegypti ، وربيناها إلى 4إنستار ، وجمعنا جراثيم E. aedis من اليرقات المصابة. ثم أصابنا أفقيًا اليرقات الصحية بهذه الجراثيم عن طريق الابتلاع عن طريق الفم ، وربينا اليرقات المصابة أفقيًا إلى مرحلة البلوغ. نحن الدم تغذية البالغين المصابين (جيل الوالدين) وجمع البيض (جيل البنوي)، والتي افترضنا أنها ستكون مصابة عموديا مع طفيلي e. aedis. فقسنا البيض من جيل البنوة وجمعنا وتجانس مجموعة فرعية من اليرقات عندما كانوا4 نجوم. قمنا بتحديد نسبة اليرقات التي كانت مصابة بـ E. aedis وإجمالي عدد اليرقات في جميع الأفراد المصابين. وجدنا أن الغالبية العظمى (96٪ ) من النساء، و 19 في المائة، و 19 في المائة، و 19 في المائة، من الأفراد كانت مصابة وحمولة بوغ المتوسط من اليرقات المصابة كان ~ 105. نستنتج أن بروتوكول تربية تربية لدينا أدى إلى انتشار ناجحة للغاية من e. aedis في Ae. aegypti البعوض.
هناك جوانب متعددة من هذا البروتوكول قد تكون صعبة بشكل خاص للمستخدم غير المستهل. نقدم أدناه بعض المعلومات الإضافية التي قد تكون مساعدة. للأسئلة المتعلقة بتربية البعوض العامة ، دليل كامل لصيانة مستعمرة aegypti خارج نطاق هذا البروتوكول. ومع ذلك، يمكن معالجة العديد من الأسئلة الشائعة من الموارد من الدفاع الحيوي والعدوى الناشئة الموارد مستودع16،17 بما في ذلك فقس البيض، والاحتياجات الغذائية العامة، والإسكان والظروف البيئية، وتغذية الدم. فيما يتعلق بالجدول الزمني للعدوى ، لا تظهر علامات العدوى على اليرقات المفقوسة من البويضات المصابة حتى وقت متأخر من مرحلة4 إنستار. تظهر الأباجن أحادية النواة بسرعة، على مدى 1-2 أيام. قد تظهر اليرقات غير مصابة تقريبًا في 6 أيام بعد الفقس ولكنها مصابة بشدة بحلول اليوم السابع أو الثامن بعد الفقس. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من الصعب تصور الجراثيم في عينات متجانسة لأن هناك العديد من الميكروبات الأخرى الموجودة في تجانس البعوض كله، بما في ذلك الكائنات الحية وحيدة الخلية النوى الأخرى (مثل الخميرة) ذات حجم مماثل للجراثيم e. aedis uninucleate. الشكل المميز لإغاثات e. aedis (الشكل 2A)هو طريقة موثوقة للغاية لتحديد الهوية وسيساعد على تمييز E. aedis عن الميكروبات الأخرى في التجانس. على الرغم من أنه ليس من الضروري لتحديد أو كم، إذا كان مطلوبا تنقية بوغ، فإنه يمكن تحقيقه عن طريق السيليكا الغروية كثافة التسرف المركزي الذي سيسمح لفصل جراثيم E. aedis من العناصر الملوثة الأخرى في التجانس. ويرد وصف هذه العملية بالتفصيل في Solter وآخرون20.
تختلف درجة الحرارة والنظام الغذائي المستخدمان في ممارسات التربية عادة بين المختبرات، ولكن من المرجح أن تؤدي الاختلافات إلى انتشار ناجح للطفيليات. الاختلافات الطفيفة في نوع الغذاء اليرقات لا تتداخل مع العدوى الناجحة، على الرغم من أننا لم اختبار صراحة أنواع مختلفة من المواد الغذائية في هذا البروتوكول. وقد تم اختبار تأثير درجة الحرارة على العدوى و E. تم العثور على عدوى aedis لتكون قوية في مجموعة واسعة من درجات الحرارة21. حدث الحد الأقصى لإنتاج البوغ عند 30.8 درجة مئوية ولكنه كان لا يزال قويا في درجات حرارة تربية منخفضة تصل إلى 20 درجة مئوية. تم تخفيض عدد البوغ بشكل كبير في درجات حرارة تربية أعلى (36 درجة مئوية)، وبالتالي ينبغي تجنب هذه درجات الحرارة لهذا البروتوكول.
التلوث هو دائما مصدر قلق عند العمل مع الطفيليات. E. aedis هو طفيلي ناجح من Ae. aegypti، وبالتالي يجب أن تبقى منفصلة عن مستعمرات المختبرات غير المصابة لمنع التلوث. نوصي بتخزين البعوض المصاب في حاضنة منفصلة إن أمكن. كما أوصينا بأن المواد المستخدمة في عمل الميكسبوريديا (مثل صواني اليرقات، الأنابيب المنقولة، الأقفاص، أكواب جمع البيض) مخصصة لعمل المجهرية غير المستخدمة على نطاق أوسع في جميع أنحاء الحشرات. يجب تعقيم جميع مواد التربية مع 10٪ التبييض بعد الاستخدام ويمكن استخدام autoclaving لتكملة التعقيم التبييض.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر سبنسر بلانكنشيب على المساعدة في تربية البعوض. كما نشكر جيمس رادل وم. دومينيك ماجيرادو على تعليقات مفيدة على المخطوطة.
Materials
| 120 mL Specimen cup | McKesson | 911759 | Inexpensive alternative to beaker |
| 150 mL beakers | VWR | 10754-950 | For larval dosing |
| 2 oz round glass bottle | VWR | 10862-502 | Bottle for 10% sucrose in adult cages |
| 3 oz. emergence cup | Henry-Schein | 1201502 | For transfer of pupae to cage |
| Adult mosquito cages | Bioquip | 1462 or 1450ASV | For adult housing |
| Autoclave | For sterilization | ||
| Bleach | For sterilization | ||
| Brewer’s yeast | Solgar | For feeding larvae during dosing | |
| Controlled rearing chamber | Tritech | DT2-MP-47L | Inexpensive small rearing chamber |
| Cotton roll | VWR | 470161-446 | Wick for sugar bottles |
| Defibrinated rabbit blood | Fisher | 50863762 | For blood feeding adults |
| Disodium ATP, crystalline | Sigma-Aldrich | A26209-5G | For blood feeding adults |
| Dry cat food | 9Lives | Indoor Complete | For general larval rearing |
| Fish food flakes | TetraMin | For general larval rearing | |
| Hemocytometer | Fisher | 267110 | For counting spores |
| Homogenizer/mixer motor | VWR | 47747-370 | For homogenizing infected larvae |
| Larval rearing trays | Sterillite | 1961 | Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4" |
| Liver powder | NOW foods | 2450 | For feeding larvae during dosing |
| Pipette 1 – 10µL | VWR | 89079-962 | For larval dosing |
| Pipette 100 – 1000µL | VWR | 89079-974 | For food during larval dosing |
| Pipette tips 1 – 10µL | VWR | 10017-042 | For larval dosing |
| Pipette tips 100 – 1000µL | VWR | 10017-048 | For food during larval dosing |
| Plastic pestles | VWR | 89093-446 | For homogenizing infected larvae |
| Sucrose, crystalline | Life Technologies | 15503022 | For adult feeding |
| Transfer pipet | VWR | 414004-033 | For larval transfer, must trim ends |
References
- Yellow fever. World Health Organization Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever (2019)
- Dengue and severe dengue. World Health Organization Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020)
- Weaver, S. C. Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community. Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).
- Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).
- Becnel, J. J. Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , 20-24 (1990).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).
- Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).
- Hembree, S. C., Ryan, J. R. Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand. Mosquito News. 42, 49-54 (1982).
- Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).
- Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).
- Becnel, J. J., Johnson, M. A. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).
- Andreadis, T. G. Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).
- Becnel, J. J. Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms. Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).
- Undeen, A. H., Becnel, J. J. Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores. Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).
- Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. Automated mass rearing system for insect larvae. , (2018).
- Methods in Aedes Research. BEI Resources Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf (2016)
- Methods in Anopheles Research. BEI Resources Available from: https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf (2014)
- Desjardins, C. A., et al. Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes. Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).
- Hembree, S. C. Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand. Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).
- Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 329-371 (2012).
- Becnel, J. J., Undeen, A. H. Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).
