Propagation of the Microsporidian Parasite <em>Edhazardia aedis</em> in <em>Aedes aegypti</em> Mosquitoes

Anthony Grigsby; Brendan  J. Kelly; Neil  D. Sanscrainte; James  J. Becnel; Sarah  M. Short

doi:10.3791/61574

JoVE Journal > Immunology and Infection

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Immunology and Infection

Aedes aegypti Sivrisinekmikrosporidian Parazit Edhazardia aedis yayılması

Published: August 13, 2020

doi:

10.3791/61574

Anthony Grigsby*¹, Brendan J. Kelly*¹, Neil D. Sanscrainte², James J. Becnel², Sarah M. Short¹

¹Department of Entomology,The Ohio State University, ²USDA/ARS Center for Medical, Agricultural, and Veterinary Entomology

Summary

Kültür mikrosporidian parazit Edhazardia aedisiçin bir protokol . Parazit aedes aegypti sivrisinek bir nesil sonraki larva aşamasında yatay transfer ve yetişkin aşamasında dikey iletim takip yoluyla geçit edilir. Canlı sporoplazmlar enfekte yumurtalarda uzun süreli hayatta kalırlar.

Abstract

Edhazardia aedis Aedes aegypti sivrisinekbir mikrosporidian parazit, her yıl hastalık vakaları milyonlarca neden birden fazla arboviruses ileten bir hastalık vektörüdür. E. aedis sivrisinek vektöründe mortalite ve azalmış üreme uygunluğuna neden olur ve biyokontrol ajanı olarak potansiyeli araştırılmıştır. E. aedis’in kültüre atımı için sunduğumuz protokol, sivrisinek konakının farklı yaşam evrelerinde hem yatay hem de dikey iletimi içeren doğal enfeksiyon döngüsüne dayanmaktadır. Ae. aegypti sivrisinekler larva aşamasında sporlara maruz kalmaktadır. Bu enfekte larvalar daha sonra yetişkinlere olgunlaşır ve paraziti yavrularına dikey olarak iletirler. Enfekte yavrular daha sonra gelecekteki yatay iletim için sporkaynağı olarak kullanılır. Culturing E. aedis parazityaşam döngüsünün karmaşıklığı göz önüne alındığında uninitiated zor olabilir, ve bu protokol açıklama için ayrıntılı rehberlik ve görsel yardımlar sağlar.

Introduction

Aedes aegypti birden fazla arboviruses sivrisinek vektörüdür (örneğin, dang, Zika, sarı humma) birlikte her yıl hastalık vakalarıyüzmilyonlarca ve 30.000 ‘den fazla ölüm¹,²hesap tahmin edilmektedir . Bu patojenlerin neden olduğu hastalıkların tedavisi destekleyici bakım ile sınırlıdır ve gelecekte ek arbovirüslerin ortaya çıkması muhtemeldir³. Bu nedenle sivrisinek vektörünün kontrolü birincil öneme sahiptir, çünkü mevcut ve gelişmekte olan patojenlerin bulaşmasını etkin bir şekilde önler^4. Geleneksel olarak, vektör kontrol stratejileri öncelikle kimyasal insektisitler kullanmak, ancak birçok yaygın olarak kullanılan insektisitler direnç vektör kontrolü yeni yöntemler için talep tahrik etmiştir. Ae. aegypti karşı biyokontrol özellikleri için araştırılmış olan bir potansiyel ajan parazit Edhazardia aedis⁵^,⁶.

E. aedis, ilk olarak 1930 yılında Kudo tarafından Nosema aedis olarak tanımlanan, Ae. aegypti sivrisinek⁷bir mikrosporidian parazit . E. aedis gelişimi ve üreme nispeten karmaşık ve yaşam döngüsü birden fazla şekilde devam edebilirsiniz⁷^,⁸^,⁹. Becnel ve ark., 1989^7’de derinlemesine açıklanan yaygın bir gelişim döngüsü (Şekil 1)⁸. Kısaca, döngüsü ne zaman Ae. aegypti yumurta dikey E. aedis ile enfekte yağ vücudunda uninucleate sporları geliştirmek enfekte larvaiçine yumurtadan başlar, ve genellikle larva veya pupa olarak ölmek. Ölü larvalardan salınan uninucleate sporlar yaşam alanını kirletir ve sağlıklı Ae. aegypti larvaları tarafından yutulmaktadır. Bu sporlar öncelikle sindirim sisteminde çimlenir, maruz kalan larvaların sindirim dokusunu enfekte ederek yatay iletimle sonuçlanır. Yatay enfekte larvalar, binükleat sporlarının oluştuğu yetişkinlere (ebeveyn nesli) dönüşür. Dişide, bu binükleat sporları üreme sistemi işgal ve ilişkili sporoplazm gelişmekte olan yumurta hücrelerini enfekte. Bu yumurtalar daha sonra enfekte larvalar içine yumurtadan (filial nesil), parazit dikey iletimi ve yukarıda açıklandığı gibi döngüsünün devamı ile sonuçlanan.

Birçok çalışma biyokontrol için E. aedis potansiyelini araştırdık. E. aedis enfeksiyonua neden olduğu gösterilmiştir Ae. aegypti dişilerin üreme kapasitesi azalmıştır¹⁰. Ayrıca, bir yarı alan deneyde, E. aedis inundative sürümü bir test Ae. aegypti popülasyon taramalı muhafaza içinde tutulan toplam eradikasyon sonuçlandı⁶. Sivrisinek türlerinin çeşitli bir dizi geliştirme bazı aşamalarında geçmesi mümkün iken, E. aedis sadece dikey Ae. aegyptiiletilir , ev sahibi özgüllük yüksek derecede gösteren¹¹^,¹². Aynı şekilde, E. aedisile ilişkili potansiyel çevresel riskin bir laboratuvar değerlendirmesinde, mikrosporidian parazit E. aedis¹³ile enfekte Ae. aegypti larvaları yutulan yırtıcılar da dahil olmak üzere, hedef olmayan sucul fauna, enfekte başarısız oldu. Bu sonuçlar, Doğal Ae. aegypti popülasyonlarını hedefleyen biyolojik kontrol stratejilerinde E. aedis’in kullanılma potansiyelini vurgulamaktadır.

E. aedis vektör kontrolünde kullanım için umut vaat etmesine rağmen, onu daha geniş bir ölçekte dağıtmak ve katmanlamak için zorluklar vardır. E. aedis sporları soğuk sıcaklıklarda (yani 5 °C) bir günden daha kısa sürede enfektiflik kaybederler. Daha sıcak sıcaklıklarda bile (yani, 25 °C), sporlar üç hafta boyunca hızla enfekteliğini^{kaybederler 14.} Ayrıca, E. aedis canlı Ae. aegypti sivrisinek kültürlü olmalı ve sağlıklı larva sivrisinek kontrollü dosing yaşam döngüsünün tamamlanmasını sağlamak ve kültür için kullanılan nüfusun çöküşünü önlemek için gereklidir⁸. In vivo culturing gereksinimi bir meydan okuma sunuyor; ancak, sivrisinek kütle yetiştirme ve robotik (örneğin, Massaro ve ark.¹⁵⁾son gelişmeler E. aedis sporların büyük ölçekli nesil için izin verebilir. Bu metodolojinin görselleştirilmesinin E. aedis yetiştirme protokolüne erişilebilirliği artıracağını ve daha fazla araştırmacının bu sistemin temel biyolojisini ve uygulama potansiyelini araştırmasına olanak sağlayacağını öngörüyoruz. Ayrıca mühendisler, robotikçiler ve E. aedis’inkitlesel yetiştirilmesine hizmet edecek daha geniş teknoloji sektörü ile artan işbirliklerini kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.

Şekil 1: Ae. aegypti’de E. aedis yayılımı. E. aedis’in yayılması yumurtadan çıkma ile başlar E. aedis enfekte yumurta. Enfekte larvalar⁴ instar, E. aedis sporları bu larvalar izole edilir ve sporlar ağızdan sağlıklı enfekte etmek için kullanılır 2^nd^/3 yumurta bir enfekte debriyaj (yatay iletim). Bu sözlü enfekte larvalar daha sonra yetişkinlik (ebeveyn nesil) yetiştirilen ve Yumurtlama Yumurtlama E. aedis (dikey iletim) ile enfekte. Enfekte yumurta (filial nesil) daha sonra enfeksiyon döngüsü ve parazit kültürü devam etmek için yumurtadan vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protocol

1. Gün 0 Hatch Ae. aegypti yumurta larva yetiştirme tepsisi yerleştirerek E. aedis ile enfekte 1 L deiyonized (DI) su. Balık gıda 50 mg ekleyin.NOT: Yayın sırasında, E. aedis’in laboratuvar türü sadece paraziti aktif olarak araştıran laboratuvarlardan temin edilebilir, çünkü E. aedis uzun süreli depolamaya elverişli değildir ve enfekte yumurtalar şu anda depolarda depolanmamaktadır. E. aedis ile çalışmak isteyen araştırmacılar enfekte yumurta istemek için ilgili yazarla iletişime geçebilirler.NOT: Çok sayıda enfekte yumurtanın yumurtadan çıkması genellikle gerekli değildir; on E. aedis enfekte Ae. aegypti larvaları 1000 sağlıklı larva≥ doz için yeterlidir.NOT: Bu protokolün tüm bölümleri için sivrisinekleri aşağıdaki koşullarda barındırdık: 14 saat/10 h ışık/karanlık döngü, 27 °C sıcaklık ve bağıl nem. 2. Gün 1 Yumurtadan çıktıktan sonra larva yoğunluğunu tepsi başına ~100 larvaya düşürün ve gerektiğinde yeni tepsiler yapın (ayrıca 1 L DI su ile). Her tepsiye bir parça kuru kedi maması ekleyin. Tükenmiş gıda doldurmak, ancak gıda fazlalığı sağlamaz. Her üç günde bir bir parça kedi maması (~200 mg) yeterlidir.NOT: Belirli yetiştirme koşullarına bağlı olarak gıda miktarını ayarlayın (örneğin, su bulanıklaşırsa veya larvalar ölüyorsa gıdayı azaltın, larvalar gelişmede ciddi şekilde gecikirse gıdayı artırın). Burada önerilenlerden daha diğer besleme rejimleri ve/veya yetiştirme koşulları kullanılabilir, ancak bu standart protokolün zamanlamasında ayarlamalar gerekebilir. 3. Gün 4\u20125 Enfekte larvalar 3 -4 yıldız olduğunda, yeni bir tepside sağlıklı/enfekte olmamış Ae. aegypti yumurtaları yumurtadan çıkar. Sağlıklı Ae. aegypti ulaşmak gibi yoğunluklarda arka 48-72 h2 -3 instar ulaşmak. Elimizde, bu gıda reklam libitum erişimi ile su 1 L başına 200\u2012300 larva yoğunlukları kullanılarak elde edilebilir. Birden fazla gün boyunca sağlıklı yumurta kuluçka parti rırvaları gerektiğinde doğru aşamada olduğunu garanti edebilir. 4. Gün 7\u20128: Yatay iletim NOT: Sağlıklı larvaların E. aedis ile dosing iması, tek nükleoz sporları enfekte larvalarda yüksek sayılarda (larva başına 1 x 104 – 1 x 106) yüksek sayılarda bulunana kadar yapılamaz. Bu 4instar aşamasında geç oluşur (Şekil 2). Uninucleate sporlarını hasat edin ve ölçün. 10 enfekte larvayı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe taşımak için transfer pipeti (ucu daha geniş çapa kadar kesmek gerekebilir) kullanın. Bir transfer pipet ile ıslah suyu çıkarın ve temiz DI su ~ 1 mL ekleyerek bir kez yıkayın. Yıkama suyunu bir pipetle çıkarın, 10 larvaya 500 μL temiz DI suyu ekleyin ve bir havaneli ve mekanik homogenizer kullanarak homojenize edin. 400x büyütme de bir hemositometre kullanarak sporları ölçmek.NOT: Uninucleate sporlar farklı piriform şekli (yani, armut şekli; Şekil 2A). Doz sağlıklı Ae. E. aedis ile aegypti larvaları. 1,2 g karaciğer tozu, 0,8 g bira mayası ve 100 mL su karıştırarak taze larva gıda bulamacı yapın.NOT: Gıdaların otoklavlaved ve kullanıma kadar 4 °C’de saklanmış ise taze olması gerekmez. Transfer 100 2- 3 instar sağlıklı Ae. aegypti larvaları içine 150 mL beaers veya örnek bardak. Doz 5 x 104 ile 100 larva her kabı – 1 x 105 sporlar. 100 mL’lik son hacmine 2 mL larva gıda bulamacı ve DI su ekleyin. Pozlama 12-24 saat sonra, standart bir yetiştirme protokolü16aşağıdaki yetiştirme tepsileri içine maruz larva ve yetişkinlik arka transfer . 5. İzleme ve dikey iletim Onlar bir kafeste bir ortaya çıkma fincan geliştirmek gibi yavru ve transfer pupa için monitör dosed larvaları. Şeker yem yetişkin reklam libitum (16 başına,17). Eclosing yetişkinler E. aedistarafından enfekte olacak. Kan besleme yetişkin (16başına ,17) ve yumurta toplamak. E. aedis’in dikey iletimi bu adımda gerçekleşir.NOT: Oviposition tamamlanır tamamlanmaz ek kan öğünleri sağlanırsa, dişiler yetişkinler (genellikle ani) yüksek mortalite düzeyleri ne kadar acı çekmeden önce en az bir debriyaj daha yumurta yatırabilirler. Bu protokolün 1. NOT: Yumurtalar uygun koşullarda 2 – 3 ay saklanabilir16. Kontaminasyonu önlemek için E. aedis ile temas eden tüm malzemeleri çamaşır suyu ve otoklavlama (mümkünse) ile temizleyin.

Representative Results

E. aedis enfekte Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12)yumurtaları yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi yumurtadan çıktı. 4. instar evresinde, enfekte larvaların yağ vücutlarındaki beyaz spor kistleri de dahil olmak üzere görsel enfeksiyon belirtileri görülebilir (Bu fenotipin bir örneği Şekil 2B’degösterilmiştir). Uninucleate sporlar 500 μL DI suda 10 larva homojenleştirilerek 4instar larvasından hasat edildi. Bu sporlar piriform (armut şeklinde) idi ve 400x(Şekil 2A)ile kolayca görülebilir. Hemositometre kullanılarak 4.05 x 103 spor/μL spor sayısı hesaplandı. Yüz sağlıklı Ae. aegypti larvaları daha sonra yatay ~ 500 sporlar / larva son bir doz için 100 mL suda ~ 50.000 sporlar ile enfekte edildi. Larvalar yetişkinliğe (ebeveyn nesli) ve defibrinated tavşan kanı artı %1 (v/v) 100 mM adenozin trifosfat kullanılarak kanla beslendi. Dikey enfekte yumurta toplandı (filial nesil) ve E. aedis yayılımı devam etmek ve enfeksiyon başarısını ölçmek için yumurtadan. Kuluçkadan yedi gün sonra, 25 filial nesil larva larvalar tek tek 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarıldı ve bir kez DI suyu ile yıkandı. Di su ve enfeksiyon durumu 250 μL’de tek tek larva homojenleştirildi ve E. aedis yükleri hemositometre kullanılarak değerlendirildi. Filial jenerasyonda E. aedis dikey enfeksiyon oranı% 96 ve yedi gün sonra kuluçka enfekte bireylerin ortalama spor yükü bulundu 3.31 x 105 (Aralık: 3.25 x 104 – 1.47 x 106; Şekil 3). Şekil 2: Ae. aegypti sivrisineklerinde E. aedis enfeksiyonunun görselleştirilmesi. (A) E. aedis uninucleate piriform sporlar. Ten E. aedis enfekte 4instar larvaları yaklaşık yedi gün sonra kuluçka dan sonra 500 μL DI suda homojenize edildi. Homojenin 10 μL’si hemositometreye yüklendi ve 400X olarak izlendi. Kırmızı oklar temsili uninucleate E. aedis sporlarını gösterir. (B) E. aedis enfekte 4instar larvaları yağ vücut18boyunca ayırt edici beyaz spor kistleri geliştirmek . Ayrıca genellikle bozuk ve şişmiş karın segmentleri var. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Kültür protokolü filial jenerasyonda etkili E. aedis enfeksiyonuna yol açar. Ae. aegypti larvaları (n = 25) filial jenerasyondan 250°L DI suda ayrı ayrı homojenleştirildi ve homojenin 10 μL’si hemositometreye yüklendi. Uninucleate sporların varlığı pozitif enfeksiyon gösterdi ve tüm pozitif örnekler için sporlar ölçüldü. (A) Filial larvalar arasında enfeksiyon prevalansı. Gri enfekte olmamış larvalara, siyahın enfekte olduğu anlamına gelir. Her segmentte görüntülenen sayılar, her gruptaki bireylerin mutlak sayısını verir. (B) Enfekte olan her birey için spor yükü. Siyah nokta günlük temsil10 her larva için uninucleate spor sayısı dönüştürülmüş. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada yöntem aslında Hembree ve Ryan, 1982⁸ Ae. aegypti sivrisinek E. aedis microsporidia yetiştirme için açıklanan sunuyoruz. Bu çalışmada kullanılan E. aedis suş 1979 yılında Tayland Stephen Hembree tarafından orijinal alan koleksiyonundan türetilmiştir 1979¹⁹. Yöntem, paraziti kontrollü bir şekilde yaymakiçin doğal olarak E. aedis⁷iletim döngüsünde oluşan yatay iletimden yararlanılır. Bu yöntem spor görünümü, larvaenfeksiyon belirtileri, ya da başarıyla çok aşamalı yetiştirme / dosing protokolü tamamlamak için gerekli koordinasyon aşina olmayan yeni gelenler için zor olabilir. Umudumuz, bu protokole eşlik eden görsel yardımların E. aedis kültürünü isteyen araştırmacıların giriş engellerini azaltmasıdır.

Yukarıda açıklandığı gibi Ae. aegypti’de E. aedis’i yaydık ve filial jenerasyonda parazitizmin başarısını ölçtün. Kısaca, E. aedis enfekte Ae. aegypti yumurta,⁴ instar onları yetiştirilen ve enfekte larvalar uninucleate E. aedis sporları toplandı. Daha sonra yatay oral yutma yoluyla bu sporlar ile sağlıklı larva enfekte, ve yetişkinlik için yatay enfekte larva yetiştirilen. Biz kan enfekte yetişkinler (ebeveyn nesil) beslenen ve yumurta (filial nesil), biz varsayımsal yumurta, dikey E. aedis parazit ile enfekte olacağını. Filial neslinden yumurtalar çıkarmış ve larvaların bir alt kümesini toplayıp homojenize ettik. E. aedis ile enfekte olan larvaların yüzdesini ve tüm enfekte bireylerdeki toplam spor sayısını ölçtük. Biz büyük çoğunluğu (%96) bulundu bireylerin enfekte edildi ve enfekte larvaortalama spor yükü ~ 10⁵oldu. Yetiştirme protokolümüzün Ae. aegypti sivrisineklerinde E. aedis’in son derece başarılı bir şekilde yayılmasıyla sonuçlandığı sonucuna varıyoruz.

Bu protokolün, özellikle başlatılmamış kullanıcı için zor olabilecek birden çok yönü vardır. Aşağıda yardımcı olabilecek bazı ek bilgiler sunuyoruz. Genel sivrisinek yetiştirme ile ilgili sorular için, Ae. aegypti koloni bakım için tam bir rehber bu protokolün kapsamı dışındadır. Ancak, birçok ortak sorular Biyosavunma ve Gelişmekte Olan Enfeksiyonlar Araştırma Kaynakları Deposu^16,¹⁷ yumurtadan, genel diyet ihtiyaçları, konut ve çevre koşulları ve kan besleme de dahil olmak üzere kaynaklar tarafından ele alınabilir. Enfeksiyon zaman çizelgesi ile ilgili olarak, enfekte yumurtadan larvalar⁴ instar aşamasında geç kadar enfeksiyon belirtisi göstermez. Uninucleate sporlar hızla görünür, 1-2 gün boyunca. Larvalar 6 gün sonra kuluçkadan sonra neredeyse enfekte olmamış görünebilir ler ancak 7 veya 8 gün sonra çok enfekte olmuş olabilirler. Ayrıca, homojenize örneklerde sporları görselleştirmek zor olabilir, çünkü tüm sivrisinek homojenatlarında bulunan diğer birçok mikrop vardır, buna E. aedis uninucleate sporlar gibi benzer boyuttaki diğer ökaryotik tek hücreli organizmalar (örneğin, maya) da dahildir. E. aedis sporlarının ayırt edici şekli(Şekil 2A)tanımlama için son derece güvenilir bir yöntemdir ve E. aedis’in homojendeki diğer mikroplardan ayırt edilmesine yardımcı olur. Tanımlama veya niceleme için gerekli olmasa da, spor arınması isteniyorsa, E. aedis sporlarının homojendeki diğer kirletici elementlerden ayrılmasına olanak sağlayacak kolloidal silika yoğunluk gradyan santrifüj ile elde edilebilir. Bu süreç Solter ve ark.^20’deayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Yetiştirme uygulamalarında kullanılan sıcaklık ve diyet genellikle laboratuvarlar arasında farklılık gösterir, ancak varyasyonlar büyük olasılıkla hala başarılı parazit yayılımı sağlayacaktır. Larva gıda tipindeki küçük farklılıklar başarılı enfeksiyona engel değildir, ancak bu protokolde farklı gıda türlerini açıkça test etmedik. Sıcaklık enfeksiyonu üzerindeki etkisi test edilmiştir ve E. aedis enfeksiyonu²¹sıcaklık geniş bir yelpazede sağlam olduğu bulunmuştur. Maksimum spor üretimi 30.8 °C’de meydana geldi ancak 20 °C’ye kadar düşük yetiştirme sıcaklıklarında hala sağlamdı. Spor sayısı yüksek yetiştirme sıcaklıklarında (36 °C) önemli ölçüde azalmıştır, bu nedenle bu protokol için bu sıcaklıklardan kaçınılmalıdır.

Parazitlerle çalışırken kontaminasyon her zaman bir sorundur. E. aedis Ae. aegypti başarılı bir parazit ve bu nedenle kontaminasyonu önlemek için enfekte olmayan laboratuvar kolonileri ayrı tutulmalıdır. Mümkünse enfekte sivrisineklerin ayrı bir kuvözde depolanmasını öneriyoruz. Ayrıca mikrosporidia çalışması için kullanılan malzemelerin (örneğin, larva tepsileri, transfer pipetleri, kafesler, yumurta toplama kapları) mikrosporidia çalışmaları için belirlenmesini ve böcek boyunca daha geniş bir şekilde kullanılmaması önerilir. Tüm yetiştirme malzemeleri kullanımdan sonra %10 çamaşır suyu ile sterilize edilmelidir ve otoklavlama çamaşır suyu sterilizasyonunu tamamlamak için kullanılabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Spencer Blankenship’e sivrisinek yetiştiriciliğinde yardım ları için teşekkür ederiz. Ayrıca James N. Radl ve M. Dominique Magistrado’ya el yazması hakkında yararlı geri bildirimler için teşekkür ederiz.

Materials

120 mL Specimen cup	McKesson	911759	Inexpensive alternative to beaker
150 mL beakers	VWR	10754-950	For larval dosing
2 oz round glass bottle	VWR	10862-502	Bottle for 10% sucrose in adult cages
3 oz. emergence cup	Henry-Schein	1201502	For transfer of pupae to cage
Adult mosquito cages	Bioquip	1462 or 1450ASV	For adult housing
Autoclave			For sterilization
Bleach			For sterilization
Brewer’s yeast	Solgar		For feeding larvae during dosing
Controlled rearing chamber	Tritech	DT2-MP-47L	Inexpensive small rearing chamber
Cotton roll	VWR	470161-446	Wick for sugar bottles
Defibrinated rabbit blood	Fisher	50863762	For blood feeding adults
Disodium ATP, crystalline	Sigma-Aldrich	A26209-5G	For blood feeding adults
Dry cat food	9Lives	Indoor Complete	For general larval rearing
Fish food flakes	TetraMin		For general larval rearing
Hemocytometer	Fisher	267110	For counting spores
Homogenizer/mixer motor	VWR	47747-370	For homogenizing infected larvae
Larval rearing trays	Sterillite	1961	Overall dimensions are 11" x 6 5/8" x 2 3/4"
Liver powder	NOW foods	2450	For feeding larvae during dosing
Pipette 1 – 10µL	VWR	89079-962	For larval dosing
Pipette 100 – 1000µL	VWR	89079-974	For food during larval dosing
Pipette tips 1 – 10µL	VWR	10017-042	For larval dosing
Pipette tips 100 – 1000µL	VWR	10017-048	For food during larval dosing
Plastic pestles	VWR	89093-446	For homogenizing infected larvae
Sucrose, crystalline	Life Technologies	15503022	For adult feeding
Transfer pipet	VWR	414004-033	For larval transfer, must trim ends

References

Yellow fever. World Health Organization Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever (2019)
Dengue and severe dengue. World Health Organization Available from: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue (2020)
Weaver, S. C. Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community. Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).
Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection. Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).
Becnel, J. J. Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , 20-24 (1990).
Becnel, J. J., Johnson, M. A. Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).
Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae). Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).
Hembree, S. C., Ryan, J. R. Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand. Mosquito News. 42, 49-54 (1982).
Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).
Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).
Becnel, J. J., Johnson, M. A. Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).
Andreadis, T. G. Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes. Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).
Becnel, J. J. Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms. Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).
Undeen, A. H., Becnel, J. J. Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores. Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).
Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. T. Automated mass rearing system for insect larvae. , (2018).
Methods in Aedes Research. BEI Resources Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf (2016)
Methods in Anopheles Research. BEI Resources Available from: https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf (2014)
Desjardins, C. A., et al. Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes. Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).
Hembree, S. C. Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand. Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).
Solter, L. F., Becnel, J. J., Vávra, J. Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists. Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 329-371 (2012).
Becnel, J. J., Undeen, A. H. Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes. J. Vis. Exp. (162), e61574, doi:10.3791/61574 (2020).

Automatically Generated