Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Wir präsentieren hier die methode ursprünglich beschrieben in Hembree und Ryan, 1982⁸ für die Aufzucht E. aedis microsporidia in Ae. aegypti Mücken. Der stamme von E. aedis, der in dieser Studie verwendet wurde, wurde aus der ursprünglichen Feldsammlung von Stephen Hembree in Thailand im Jahr 1979¹⁹abgeleitet. Die Methode wird auf horizontale Übertragung, die natürlicherweise im Übertragungszyklus von E. aedis⁷auftritt, um den Parasiten in kontrollierter Weisezu vermehren. Diese Methode kann für Neulinge, die nicht mit Sporenaussehen, Symptomen einer Infektion bei Larven oder der Koordination erforderlich, um erfolgreich das mehrstufige Aufzucht/Dosierungsprotokoll abzuschließen, eine Herausforderung darstellen. Wir hoffen, dass die visuellen Hilfsmittel, die dieses Protokoll begleiten, die Zugangsbarrieren für Forscher verringern werden, die E. aedis kulturieren möchten.

Wir propagierten E. aedis in Ae. aegypti, wie oben beschrieben, und quantifizierten den Erfolg des Parasitismus in der kindlichen Generation. Kurz, wir schlüpften E. aedis infiziert Ae. aegypti Eier, zog sie auf 4^th instar, und sammelte uninucleate E. aedis sporen von den infizierten Larven. Wir infizierten dann horizontal gesunde Larven mit diesen Sporen durch orale Einnahme und züchteten die horizontal infizierten Larven bis ins Erwachsenenalter. Wir bluten die infizierten Erwachsenen (Elterngeneration) und sammelten Eier (kindliche Generation), von denen wir vermuteten, dass sie vertikal mit dem E. aedis-Parasiten infiziert wären. Wir schlüpften Eier aus der kindlichen Generation und sammelten und homogenisierten eine Teilmenge der Larven, als sie 4^th instars waren. Wir quantifizierten den Prozentsatz der Larven, die mit E. aedis infiziert waren, und die Gesamtzahl der Sporen bei allen infizierten Personen. Wir stellten fest, dass die überwiegende Mehrheit (96%) von Einzelpersonen infiziert waren und die durchschnittliche Sporenbelastung der infizierten Larven betrug¹⁰⁵. Wir kommen zu dem Schluss, dass unser Aufzuchtprotokoll zu einer sehr erfolgreichen Vermehrung von E. aedis in Ae. aegypti-Mücken geführt hat.

Es gibt mehrere Aspekte dieses Protokolls, die für den nicht initiierten Benutzer besonders schwierig sein können. Wir bieten im Folgenden einige zusätzliche Informationen, die helfen können. Für Fragen zur allgemeinen Mückenzucht ist ein vollständiger Leitfaden zur Erhaltung der Ae. aegypti-Kolonie außerhalb des Rahmens dieses Protokolls. Jedoch, viele häufige Fragen können durch Ressourcen aus der Biodefense und Emerging Infections Research Resources Repository¹⁶,¹⁷ einschließlich Eibrühe, allgemeine Ernährungsbedürfnisse, Gehäuse und Umweltbedingungen, und Blutfütterung behandelt werden. In Bezug auf den Zeitplan der Infektion, Larven aus infizierten Eiern geschlüpft zeigen keine Anzeichen einer Infektion bis spät in der^4. Instar-Phase. Uninuleate Sporen erscheinen schnell, im Laufe von 1-2 Tagen. Larven können praktisch uninfiziert erscheinen an 6 Tagen nach dem Schlüpfen, aber hoch infiziert durch Tag 7 oder 8 nach dem Schlüpfen. Darüber hinaus kann es schwierig sein, Sporen in homogenisierten Proben zu visualisieren, da es viele andere Mikroben gibt, die in ganzen Mückenhomogenaten vorhanden sind, einschließlich anderer eukaryotischer einzelliger Organismen (z. B. Hefe) ähnlicher Größe wie die E. aedis uninucleate Sporen. Die unterscheidungskräftige Form von E. aedis sporen (Abbildung 2A) ist eine sehr zuverlässige Methode zur Identifizierung und wird dazu beitragen, E. aedis von anderen Mikroben im Homogenat zu unterscheiden. Obwohl es für die Identifizierung oder Quantifizierung nicht notwendig ist, kann, wenn sporenreinigung gewünscht wird, durch kolloidale Kieselsäuredichte Gradientzentrifugation erreicht werden, die eine Trennung von E. aedis Sporen von anderen kontaminierenden Elementen im Homogenat ermöglicht. Dieser Prozess wird ausführlich in Solter et al.²⁰beschrieben.

Temperatur und Ernährung, die in Deraufzuchtpraktiken verwendet werden, unterscheiden sich häufig zwischen den Laboratorien, aber Variationen werden wahrscheinlich immer noch zu einer erfolgreichen Parasitenausbreitung führen. Geringfügige Unterschiede in der Larvenfutterart stören die erfolgreiche Infektion nicht, obwohl wir in diesem Protokoll nicht explizit verschiedene Lebensmitteltypen getestet haben. Die Auswirkungen der Temperatur auf die Infektion wurde getestet und E. aedis Infektion wurde festgestellt, dass robust bei einem breiten Bereich von Temperaturen²¹. Die maximale Sporenproduktion erfolgte bei 30,8 °C, war aber bei Aufzuchttemperaturen von bis zu 20 °C immer noch robust. Die Sporenzahl wurde bei höheren Aufzuchttemperaturen (36 °C) drastisch reduziert, daher sollten diese Temperaturen für dieses Protokoll vermieden werden.

Kontamination ist immer ein Problem bei der Arbeit mit Parasiten. E. aedis ist ein erfolgreicher Parasit von Ae. aegypti und muss daher von nicht infizierten Laborkolonien getrennt gehalten werden, um eine Kontamination zu verhindern. Wir empfehlen, infizierte Mücken nach Möglichkeit in einem separaten Inkubator zu lagern. Wir empfehlen auch, dass Materialien, die für Mikrosporidien verwendet werden (z. B. Larvenschalen, Transferpipetten, Käfige, Eiersammelbecher), für Mikrosporidien-Arbeiten bestimmt sind und nicht im gesamten Insektaum breiter verwendet werden. Alle Aufzuchtmaterialien sollten nach Gebrauch mit 10% Bleichmittel sterilisiert werden und Autoklavieren können verwendet werden, um die Bleichsterilisation zu ergänzen.