Este protocolo descreve uma aplicação de fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) para medir a cinética in vivo da síntese e degradação do mRNA.
Fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) permite contar o número absoluto de mRNAs em células individuais. Aqui, descrevemos uma aplicação de smFISH para medir as taxas de transcrição e degradação do mRNA em Escherichia coli. Como o smFISH é baseado em células fixas, realizamos smFISH em vários pontos de tempo durante um experimento de curso de tempo, ou seja, quando as células estão passando por alterações sincronizadas após a indução ou repressão da expressão genética. Em cada ponto de tempo, sub-regiões de um mRNA são espectralmente distinguidas para o alongamento da transcrição da sonda e término prematuro. O resultado deste protocolo também permite analisar a localização intracelular de mRNAs e heterogeneidade em números de cópias mRNA entre as células. Usando este protocolo muitas amostras (~50) podem ser processadas dentro de 8h, como a quantidade de tempo necessária para apenas algumas amostras. Discutimos como aplicar este protocolo para estudar a transcrição e a cinética de degradação de diferentes mRNAs em células bacterianas.
O fluxo de informações genéticas do DNA para o mRNA e da proteína é um dos processos celulares mais fundamentais, cuja regulação é importante para a aptidão celular1. O número de mRNAs em uma célula é determinado por dois processos dinâmicos, transcrição e degradação do mRNA. No entanto, como a transcrição e a degradação do mRNA são reguladas no tempo e no espaço de uma única célula não é completamente compreendida, em grande parte devido à escassez de métodos experimentais para medir quantitativamente sua cinética in vivo.
Métodos baseados em mRNAs totais extraídos de uma população de células, como mancha do Norte, RT-PCR, sequenciamento de RNA e microarrays de expressão genética, podem medir a diferença relativa nos níveis de mRNA e têm sido amplamente utilizados para analisar a taxa de alongamento da transcrição2,,3,,4,5 ou a taxa de degradação do mRNA6,,7. No entanto, eles não fornecem o número absoluto de mRNAs por célula e, portanto, não são adequados para sondar a taxa de iniciação de transcrição8. Além disso, como os mRNAs são extraídos de uma população de células, a distribuição espacial de mRNAs dentro de uma única célula e a variabilidade dos números de cópias mRNA entre as células não podem ser medidas.
O sequenciamento de RNA de última geração em células individuais (scRNAseq) pode quantificar o número de mRNAs por célula em uma escala genômica9. No entanto, ainda é difícil usar essa técnica para medir a cinética de transcrição, devido a desafios com preparação amostral e alto custo. Em particular, a aplicação de scRNAseq a bactérias tem sido tecnicamente difícil devido à baixa abundância de mRNA10,11.
A fluorescência de molécula única na hibridização situ (smFISH) baseia-se na hibridização de sondas de um único fio fluorescente cujas sequências são complementares ao mRNA alvo de interesse12,13. O conceito de hibridização específica de sequência é semelhante ao usado na mancha norte ou RT-PCR, mas a hibridização é feita in situ dentro de células fixas, para preservar a localização nativa de mRNAs. O sinal de um único mRNA é amplificado usando muitas sondas, ~20 nucleotídeos (nt) de comprimento, hibridizando para diferentes partes de um mRNA (Figura 1A)13. Nesta abordagem da sonda “ladrilho”, o número de sondas necessárias para detectar um único mRNA estabelece um limite menor no comprimento do mRNA que pode ser avaliado. Alternativamente, o mRNA de interesse pode ser transcritivamente fundido a uma matriz não codificadora de sequências de operadores lac tandem, de tal forma que várias cópias de uma sonda lacO fluorescentemente rotulada hibridizem para um único mRNA(Figura 1B)14.
smFISH tem sido usado para quantificar o número de mRNAs por célula em estado estável (ou seja, quando a síntese e a decadência estão em equilíbrio) e para analisar a média e variabilidade das mRNAs entre as células bacterianas15,,16,,17. Recentemente, o smFISH foi aplicado para quantificar os números de mRNA em estado não estável, logo após a indução ou repressão da expressão genética em E. coli18,,19,20. As alterações temporais nos números absolutos de cópias do mRNA foram então utilizadas para calcular a taxa de iniciação, alongamento e término da transcrição, bem como a taxa de degradação do mRNA. Para esta aplicação, os procedimentos convencionais de smFISH podem ser complicados porque existem muitas amostras, cada uma representando um ponto de tempo, que precisam passar por múltiplas etapas de troca de buffer (ou seja, centrifugação e lavagem). Aqui, descrevemos um protocolo smFISH, no qual as etapas de manuseio da amostra são dramaticamente simplificadas por ter células aderidas à superfície de um deslizamento de cobertura e aspirando líquidos com um sistema de filtragem de vácuo14,19. Utilizando-se como exemplo a expressão de lacZ em E. coli, demonstra-se o fluxo de trabalho completo (Figura 2),incluindo a análise de imagem(Figura 3) produzindo a cinética in vivo da transcrição (iniciação, alongamento e terminação) e a degradação mRNA, variabilidade célula-celular na expressão mRNA e localização mRNA. Prevemos que o protocolo é amplamente aplicável à sonda cinética in vivo e localização de outros mRNAs em várias espécies de bactérias.
Aqui, apresentamos um protocolo smFISH para medir cinética mRNA em E. coli. Nos protocolos smFISH publicados anteriormente para bactérias23, as células foram mantidas nos tubos até o final do protocolo, ou seja, até que estejam prontas para a imagem. Embora tenha muitos benefícios, como a ligação mínima e inespecífica de sondas fluorescentes na superfície do deslizamento de cobertura23,é difícil seguir esses protocolos quando há muitas amostras de um experimento de curso de tempo. Primeiro, um volume relativamente grande de células (>1 mL) precisa ser amostrado e até mesmo colhido antes da fixação. Em segundo lugar, as amostras de células precisam ser centrifugadas várias vezes para trocar soluções e lavar após a etapa de hibridização. Em nosso protocolo, um pequeno volume (<1 mL) de cultura é diretamente misturado com uma solução de fixação em um tubo de 1,5 mL, ajudando a "congelar" rapidamente o estado celular no momento da amostragem. Além disso, as células permanecem presas à superfície durante todo o procedimento, e diferentes soluções podem ser trocadas rapidamente aspirando líquidos com um sistema de filtragem a vácuo e aplicando gotas de solução de uma só vez com uma pipeta multicanal. Essa diferença torna nosso protocolo altamente vantajoso quando um grande número de amostras precisa ser processado de uma só vez. Usando nosso protocolo, 12-48 amostras podem ser manuseadas simultaneamente e todo o procedimento FISH pode ser concluído dentro de ~8 horas, cerca de um tempo semelhante necessário para algumas amostras(Figura 2). Embora tenhamos usado como exemplo a expressão de lacZ em E. coli, o protocolo é amplamente aplicável a diferentes genes e espécies bacterianas com considerações discutidas abaixo.
Para diferentes genes, a primeira coisa a considerar são sondas smFISH. Pode-se projetar sondas oligonucleotídeos que ladrilho o mRNA de interesse(Figura 1A)13. Nesta abordagem da sonda “ladrilho”, cada sonda tem ~20 de comprimento base e é rotulada com um fluoróforo no terminus de 5′ ou 3′. Esta estratégia é conveniente, pois nenhuma manipulação genética é necessária. Alternativamente, uma repetição tandem de ~20 bp sequência, estranha à sequência genômica (por exemplo, uma matriz de sequência lacO em Caulobacter crescentus14), pode ser inserida na região não traduzida de um gene de interesse e uma única sonda complementar à unidade de repetição é usada para rotular a abordagem mRNA (“array”; Figura 1B). Em ambos os casos, vários fluoroforos decoram um mRNA, dando sinal de fluorescência amplificada que pode ser facilmente diferenciado de uma única sonda inespecificamente ligada dentro de uma célula.
Se escolher abordagens de “ladrilho” ou “matriz” depende do controle negativo, uma amostra onde a ligação inespecífica de sondas é testada porque não tem o mRNA alvo. Para sondas de ladrilho(Figura 1A), uma cepa mutante sem o gene de interesse ou uma condição, na qual o gene não é transcrito (por exemplo, a repressão da lacZ) pode servir como um controle negativo para testar a ligação inespecífica de sondas. Para o smFISH baseado em matriz (Figura 1B),uma cepa de tipo selvagem sem a matriz pode servir como um controle negativo porque não contém locais de vinculação para as sondas.
As condições ideais de hibridização podem depender das sequências da sonda e até mesmo da escolha de corantes fluoróforos. Otimizamos a condição de hibridização para conjuntos de sondas lacZ mantendo a temperatura de hibridização a 37 °C e testando diferentes concentrações de conjuntos de sondas e formamida na solução de hibridização. Maiores concentrações de formamida tendem a reduzir tanto a vinculação inespecífica quanto específica26,35. Recomendamos mudar sistematicamente a hibridização e suas condições de lavagem, mantendo o tempo e a temperatura da hibridização os mesmos. À medida que a condição se torna mais rigorosa, tanto a diminuição vinculante não específica quanto específica(Figura 6). É importante encontrar um ponto em que a vinculação inespecífica comece a bater abaixo de um limiar aceitável sem comprometer ainda mais a vinculação específica. Por exemplo, usamos o nível de sinal obtido sem quaisquer sondas (“sem sondas”) como limiar(Figura 6).
O método smFISH de duas cores rotulando duas regiões separadas de um mRNA está limitado a genes longos. Para medir a taxa de alongamento da transcrição, aproveitamos o fato de que lacZ é longo (3075 bp) e sua expressão pode ser induzida pelo IPTG. Quando um gene é curto, é difícil projetar dois conjuntos de sondas de ladrilhos (perto de extremidades de 5′ e 3′) e resolver o atraso de tempo entre as aparências de 5′ vs. 3′ mRNA regiões. Neste caso, pode-se contar mRNAs nascentes em estado estável por smFISH e analisar sua distribuição com um modelo analítico que tem a taxa de alongamento de transcrição como parâmetrode montagem 20. Além disso, quando um gene de interesse não é indutor, pode-se tratar células com rifampicina no momento zero e medir a mudança temporal nas sub-regiões de 5′ e 3′ mRNA. O atraso da diminuição do sinal de 5′ mRNA para o de 3′ mRNA pode então ser usado para calcular a taxa de alongamento da transcrição como feito anteriormente31.
Finalmente, o protocolo smFISH é versátil e pode ser combinado com outros esquemas de rotulagem. Anteriormente, o lócus de DNA foi visualizado juntamente com mRNAs, combinando mRNA FISH com o DNA FISH14 ou o sistema fluorescente reporter-operator20. Os produtos proteicos podem ser visualizados pela realização de imunofluorescência juntamente com mRNA FISH14,36. Além disso, pode ser combinado com microscopia tridimensional de super-resolução37 para visualizar mRNAs nas três dimensões38,39.
The authors have nothing to disclose.
Este protocolo foi desenvolvido pela S.K. durante sua pesquisa de pós-doutorado no laboratório da Dra. Agradecemos ao Dr. Jacobs-Wagner e seus membros do laboratório por várias entradas durante o desenvolvimento do método e Laura Troyer pela leitura crítica do manuscrito. S.K. reconhece apoio do Programa De Estudiosos searle; K.V. reconhece o apoio do James Scholar Preble Research Award da Universidade de Illinois.
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |