Situハイブリダイゼーションにおける2色単分子蛍光を用いた 大腸菌 における空間と時間におけるmRNA運動学の探査
1Department of Physics,University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Center for the Physics of Living Cells,University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Carl R. Woese Institute for Genomic Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign, 4Center for Biophysics and Quantitative Biology,University of Illinois at Urbana-Champaign
Summary
このプロトコルは、mRNA合成および分解のインビボ運動を測定するための一分子蛍光をその場所でのハイブリダイゼーション(smFISH)での適用について説明する。
Abstract
その場合の単一分子蛍光(smFISH)は、個々の細胞内のmRNAの絶対数を数える。ここでは、 大腸菌における転写およびmRNA分解率を測定するためのsmFISHの適用について述べた。smFISHは固定細胞に基づいているため、時間経過実験中、すなわち細胞が遺伝子発現の誘導または抑制時に同期変化を起こしているとき、複数の時点でsmFISHを実行します。各時点で、mRNAのサブ領域は、プローブ転写伸長および早期終了とスペクトル的に区別される。このプロトコルの結果はまた、細胞間のmRNAコピー数におけるmRNAおよび異質性の細胞内局在化を分析することを可能にする。このプロトコルを使用すると、多くのサンプル(〜50)を8時間以内に処理することができます。細菌細胞における異なるmRNAの転写および分解動態を研究するために、このプロトコルを適用する方法を議論する。
Introduction
DNAからmRNAおよびタンパク質への遺伝情報の流れは、細胞の適合性にとってその調節が重要である最も基本的な細胞プロセスの1つである。細胞内のmRNAの数は、2つの動的プロセス、転写、およびmRNA分解によって決定されます。しかし、単一の細胞の時間と空間における転写およびmRNA分解がどのように調節されているかは、主に生体内でのそれらの動力学を定量的に測定する実験方法の不足のために、完全には理解されていない。
ノーザンブロット、RT-PCR、RNAシーケンシング、遺伝子発現マイクロアレイなどの細胞集団から抽出された総mRNAに基づく方法は、mRNAレベルの相対的な差を測定することができ、転写伸長率2、3、4、53,4,5またはmRNA分解率66、77を分析するために広く使用されている。しかし、それらは細胞あたりのmRNAの絶対数を提供しない、したがって、彼らは転写開始率8を調査するのに適していない。また、mRNAは細胞集団から抽出されるため、単一細胞内のmRNAの空間分布や細胞間のmRNAコピー数の変動性を測定することはできません。
個々の細胞に対する次世代RNAシーケンシング(scRNAEq)は、ゲノムスケール9における細胞当たりのmRNA数を定量することができる。しかし、サンプル調製と高コストの課題により、転写動態を測定するためにこの技術を使用することは依然として困難です。特に、細菌へのscRNAEqの適用は、mRNAの存在量が低い10,11,11のために技術的に困難であった。
この場合の一分子蛍光は、その蛍光標識された一本鎖プローブのハイブリダイゼーションに基づいており、その配列は目的とする標的mRNA12,13,13と相補的である。配列特異的ハイブリダイゼーションの概念は、ノーザンブロットまたはRT-PCRで使用される概念と同様であるが、mRNAのネイティブな局在を維持するために、ハイブリッド化は固定細胞内のその時点で行われる。単一mRNAのシグナルは、多くのプローブを用いて増幅され、〜20ヌクレオチド(nt)長さ、mRNAの異なる部分にハイブリダイズする(図1A)13。13この「タイリング」プローブアプローチでは、単一のmRNAを検出するために必要なプローブの数は、アッセイできるmRNAの長さに下限を設定します。あるいは、目的のmRNAは、タンデムLacオペレータ配列の非コード配列に転写的に融合していてもよいし、蛍光標識されたlacOプローブの複数のコピーが単一のmRNAにハイブリダイズするように(図1B)14。14
smFISHは、定常状態(すなわち、合成と崩壊のバランスが取れている場合)における細胞当たりのmRNA数を定量化し、細菌細胞15、16、17,16,17の間でmRNAの平均および変動性を分析するために使用されてきた。近年、smFISHは、大腸菌18、19、20,19,20における遺伝子発現の誘導または抑制直後に、非定常状態でのmRNA数の定量化に適用されている。その後、絶対mRNAコピー数の時間変化を使用して、転写開始率、伸長率、および終了率、ならびにmRNA分解率を計算した。このアプリケーションでは、従来のsmFISH手順は、多くのサンプルがあり、それぞれが1つの時点を表し、複数のバッファ交換ステップ(すなわち、遠心分離および洗浄)を経る必要があるため、煩雑な場合があります。ここでは、細胞をカバースリップの表面に付着させ、真空ろ過システム14,19,19で液体を吸引することによりサンプル処理工程が劇的に単純化されるsmFISHプロトコルについて説明する。大腸菌におけるlacZの発現を例として、画像解析(図3)を含む完全なワークフロー(図2)が、転写(開始、伸長、および終了)およびmRNA分解のインビボ運動を生み出す、mRNA発現における細胞間変動性、およびmRNA局在化を含む、完全なワークフロー(図2)を示す。このプロトコルは、生体内運動学のプローブや、様々な細菌種における他のmRNAの局在化に広く適用可能であることを期待しています。
Protocol
1. smFISHプローブの調製 注: smFISH プローブを単一のフルオロフォアで標識するには、NHSエステル化学21に基づいて核酸オリゴヌクレオチドを標識するための標準プロトコルに従ってください。 smFISHプローブを設計します。目的の遺伝子に「タイル」プローブまたは「アレイ」プローブ(図1)を使用するかどうかを決定します。決定方法については 、「ディスカッション 」セクションを参照してください。 「タイリング」プローブ (図 1A)については、オンラインのプローブ設計ツールを使用します (例: 資料一覧を参照)。 「アレイ」プローブ(図1B)の場合、BLASTシーケンス検索を実行して、プローブシーケンスが他のmRNA配列と相補的でないことを確認します。 lacZ mRNA転写および分解動態を研究するには、2組の2つのプローブを用いて、各セットはlacZの最初と最後の1kb領域をカバーする(3,072bp)19。注:これらのプローブセットは、以下、それぞれ「5’mRNAプローブ」および「3’mRNAプローブ」と呼ばれる。これらのプローブのシーケンスは、 材料表にリストされています。 プローブ配列を5’末端にC6アミノリンカーを有するDNAオリゴヌクレオチドとして配列をオーダーする。個々のプローブを水に1 mMに溶解します。 「5’mRNAプローブ」と「3’mRNAプローブ」セットのプローブの等量を組み合わせます。例えば 、lacZ用に設定された 5′ mRNA プローブの場合、各プローブの 20 μL (セット内のプローブの合計 24 種類) を組み合わせます。 結合プローブのエタノール沈殿22 を行い、共役反応を阻害し得る一次および二次アミン(トリス、グリシン、アンモニウム塩など)の汚染を除去する。最後に、100μLの水にDNAペレットを溶解します(プローブセットで約4.5mMのDNAを得る)。注:このステップは、プローブが製造業者によって標準的な脱塩精製を受けた場合でも推奨されます。標準的なフィルターベースの精製は、エタノール沈殿の代わりに、エタノール沈殿に加えて働く可能性があります。 5′ および 3′ mRNA プローブセットを差し分化して標識できるように、単機能性 NHS エステル部分を持つ 2 つのスペクトル的に異なるフルオロフォアを選択します。例えば、Cy5 NHSエステルを5’mRNAプローブ用に、Cy3B NHSエステルを3’mRNAプローブ用に調製します。各タイプのフルオロフォアを無水DMSOで溶解し、最終的に20mg/mL(〜25mM)にします。 各標識反応の直前に0.1 M重炭酸ナトリウム(pH 8.5)を準備します。空気への長時間の暴露は、そのpHを低下させ、標識効率を低下させます。 コンジュゲーション反応の場合は、Cy5フルオロフォアストックの15μL(ステップ1.5から)、5μLのmRNAプローブセット(ステップ1.4から)、炭酸ナトリウム75μL(ステップ1.6から)、7μLの水を組み合わせます。チューブをアルミホイルで包み、室温で3〜6時間振ります。注: インキュベーションが長いと、ラベルの効率が高くなるとは限りません。また、成分の濃度が維持されれば、反応をスケールアップまたはスケールダウンすることができる。 3’mRNAプローブセットと対応するフルオロフォア(すなわち、Cy3B NHSエステル)について上記のステップを繰り返します。 エタノール沈殿22 を行い、非反応染料分子を除去する。TE バッファーの約 50 μL にペレットを溶解します (1mM EDTA を使用して 10mM トリス-HCl pH 8.0)。 UV-Vis分光計を用いてDNAと蛍光体の濃度を推定する。 260 nm および 559 nm (Cy3B) または 649 nm (Cy5) で吸光度を測定します。サンプルが濃縮されすぎて正確な測定が得られなかった場合は、サンプルの1μLを10μLに希釈します。 吸光度を濃度に変換します。εDNA = 0.2 μM-1 (20-nt 一本鎖DNAの場合)、εCy5 = 0.25 μM-1、およびεCy3B = 0.13 μM-1注: [DNA] は、溶液内の全プローブの濃度です。個々のプローブの濃度は約24倍低い。総プローブの濃度は、この時点から「プローブ濃度」として使用されます。[DNA]と[dye]の比率が1の場合、以下のHPLCステップは23をスキップして、試料をTEバッファ内で最終的な4〜5μMに希釈する必要があります。 (推奨)ラベルなしプローブとフリー色素からラベル付きプローブを精製するには、HPLCを使用します。注: この追加の精製手順はサンプルの損失につながりますが、下流のアプリケーションに有益です。標識されていないDNAプローブを除去すると、mRNA標的からの蛍光シグナルが増加し、未反応の色素を除去すると、バックグラウンド蛍光が低下します。 HPLCを標準的な分析C18カラム、0.1 Mトリエチルランモニウムアセテート(TEAA)を緩衝Aとして、アセトニトリルを緩衝Bとして調製する。 サンプルに1 M TEAAを追加し(ステップ1.9から)0.1 M TEAAを作ります。 グラデーションプログラムを次のように設定します:0%Bで0-5分、0-30%の線形グラデーションBで5〜35分、 30-100%の線形勾配Bで35-37分、0%Bの37-40分で流量を0.1 mL/minに保ち、クロマトグラムを260および649 nm(Cy5ラベル付けサンプルの場合)または260および559nm(Cy3Bラベルサンプルの場合)に記録します。 DNAとフルオロフォアチャネルの両方で吸光度が増加したときに溶出したサンプルを収集します。 真空濃縮器を使用して溶出したサンプルを濃縮し、ペレットを50-100 μLのTEバッファに再中断します。 UV-Vis分光器を使用してDNAと蛍光素の濃度を確認してください(ステップ1.10を参照)。必要に応じて希釈して、4~5 μM付近の最終濃度を作り、プローブを-20°Cに保存します。 2. ソリューションの準備 大量のDEPC処理水および緩衝液を準備する(表1)。これらのソリューションは、室温で1年以上続くことができます。 4x固定溶液を調製し、溶液を洗浄する(表1)。 プレハイブリダイゼーション溶液とプローブハイブリダイゼーション溶液を用意する(表1)。ステップ5.1またはステップ6.1でインキュベーション中にプローブハイブリダイゼーション溶液を調製し、光への暴露を最小限に抑えるためにカバー付きの37°Cカウンタートップシェーカーに20〜40分間溶液を保持します。注:フォルマミド、SSC、プローブの濃度は 、lacZ プローブセットに最適化され、実際の信号を最大化しながらバックグラウンド蛍光を最小限に抑えました。さまざまなアプリケーションでこれらの濃度を変更する方法の詳細については、「 ディスカッション 」セクションを参照してください。 3. カバーリップとガラススライドの準備 きれいなカバーリップとガラススライド。 鉗子を使用して、個々のカバーリップとスライドをコプリンの瓶に入れます。カバーリップとスライドが離れ、互いに接触していないことを確認します。 瓶に100%エタノールを入れ、蓋を閉めます。水浴超音波クリーナーに瓶を入れ、15〜20分間超音波処理します。注:水浴の超音波装置のために、ヒーター機能をオフにすることをお勧めします。 エタノールを注ぎ、超純水3~4倍で洗います。浄水機から直接流れる水を使用してください。 瓶から水を注ぎ、70%エタノールで満たします。蓋を閉じて15〜20分間超音波処理を行い、超純水で洗浄します。 15-20分間超純水と超音波で瓶を充填します。注:カバースリップとガラススライドは、超純水で満たされたコプリン瓶に一晩保管することができます。 きれいな鉗子を使用してコプリン瓶からスライドまたはカバースリップを取り出し、N2 ガスを使用してそれを吹き飛ばします。残りのスライドとカバーリップについても、この手順を繰り返します。 ステップ 7.5 で使用するまで、乾燥したスライドをクリーンな保管ボックスに入れます。乾燥したカバーリップを空の1,000-μLピペットチップボックスに入れ、残りの手順で「チャンバー」として機能します。 疎水性マーカーを使用して、ピペットチップボックスの円形の穴に続いてカバーリップに円を描きます。これらの円(直径約0.5cm)は「ウェル」として機能します。マーカーが完全に乾燥するまで、少なくとも5〜10分待ちます。メモ:常に、先端ボックスの蓋を閉めておきます。 20-μLの0.1%ポリL-リジンを各ウェルに塗布します。室温で10〜50分間インキュベートします。メモ:このボリュームは、ウェルサイズに合わせて調整してください。ソリューションが井戸領域を完全にカバーしていることを確認します。より長いインキュベーションのために、蒸発を避けるように注意してください。 インキュベーション吸引後ポリL-リジンは、表面に触れることなくポリL-リジンはポリL-リジンを削り取る。次に、ポリL-リジン処理ウェルにDEPC水の滴(約20μL)を塗布します。ステップ5.1まで蒸発を防ぐために「チャンバー」の蓋を閉じます。 4. タイムコース実験とサンプル固定 250mLフラスコで約20mLの液体培養液中の 大腸菌 細胞を増殖させる。フラスコを水浴用シェーカー(30°C)に入れ、振り続けます。サンプルを採取する場合のみシェーカーを停止します。注:この論文で提示された結果は、0.2%グリセロール、0.1%カザミノ酸、および指数成長期(OD 600〜0.2)に1 mg/Lチアミンを添加したM9600最小培地で増殖したMG1655細胞から得られます。 空の1.5 mLチューブに4x固定溶液の250 μLを加えます。繰り返し、複数のチューブを準備します, 撮影する時間ポイントと同じ数.タイムポイント番号でチューブにラベルを付け、室温に保ちます。 タイムコース実験を開始する前に、750 μLの細胞培養(OD600~0.2)を服用してください。「時間ゼロ」のマークが付いたチューブにカルチャを追加します (ステップ 4.2 から)。チューブを緩やかに反転させ、細胞と固定溶液を混ぜます。注:細胞上でミックス、渦、または「荒い」に上下にピペットしないでください。このサンプルは、抑圧された状態を表し、単一のmRNAの蛍光強度を計算するコントロールとして使用されます(ステップ9.4を参照)。 0.02-1 mMのイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)を液体培養物に加えて lacZ 発現を誘導する。この時点でタイマーを開始し(t = 0分)、一定の時間間隔(例えば、1分ごと)でサンプルを開始します。サンプリングの場合は、ステップ 4.3 を繰り返します。 タイムコース実験中(例えばt = 1.5分)の間に、一定の時間に5mMオルソニトロフェβ-D-フココピーノシド(ONPF)または500mMグルコース24 を加えて lacZ 発現を抑制する。再抑制後、培養物をサンプリングし続ける(ステップ4.3)mRNA分解を追跡する。注:抑圧はまた、〜400 μg/mLリサンピシン、転写開始阻害剤25で行うことができます。 固定のために、サンプリングされた細胞を含むチューブを室温で15分間インキュベートし、続いて氷中で30分間インキュベートします。 固定液を除去するには、室温で4分間4,500 x g でチューブを遠心します。ピペットで上清を取り除く。注: 安全プロトコルに従って、別の廃棄物容器にホルムアルデヒドを廃棄してください。 1 mL DEPC-PBS を加え、細胞を再中断します。遠心分離を繰り返し、2倍の回数を再懸濁します。メモ:固定された細胞は壊れやすく、穏やかな治療を必要とします。慎重にペレットを再中断し、気泡を避けます。 最終洗浄工程の後、細胞を約30 μL DEPC-PBSで再懸濁します。 5. 細胞膜の透過性 各タイムポイントサンプルをカバースリップの異なるウェル(ウェルあたり30 μL)に塗布します。セルが表面に付着するまで室温で10〜30分待ちます。ウェル間の液体滴のマージを避けてください。 非結合細胞をすすぐには、液体を吸引し、各ウェルに約20μL DEPC PBSを塗布する。数分以内にDEPC PBSを吸引します。 各ウェルに4分間、15μLの70%エタノールを塗布して細胞膜を透過させる。4分後にエタノールを吸引し、井戸が完全に乾燥していることを確認します。注:エタノール処理を4分間制限することが重要です。治療が長くなるほど、過剰透過性が生じる。 洗浄液を各ウェルに30μL塗布します。 6. プローブハイブリダイゼーション 洗浄液を各ウェルから吸引する。プレハイブリダイゼーション溶液の30μLを各ウェルに適用します。37°Cオーブンでチャンバーを30分間インキュベートします。注:湿度を提供するためにチャンバーの底部に水の約50 mLを追加します。 各ウェルからプレハイブリダイゼーション溶液を吸引する。プローブハイブリダイゼーション溶液の約30μLを各ウェルに塗布します。チャンバーをアルミホイルで覆い、37°Cオーブンで2時間インキュベートします。注:このステップの前に、プローブハイブリダイゼーションソリューションが37°Cカウンタートップシェーカーに入っていることを確認してください。井戸間の液体のマージを避けてください。必要に応じて、ソリューションのボリュームを小さくして各ウェルに適用します。 7. ポストハイブリダイゼーション洗浄とイメージングの準備 マルチチャンネルピペットを使用して、洗浄液の約30μLを各ウェルに一度に塗布します。吸引し、洗浄の3〜5倍の時間を繰り返します。37°Cオーブンでチャンバーを15〜30分間インキュベートします。 ステップ 7.1 をさらに 2 回繰り返します。 DEPC-PBSで5倍に洗います。ステップ 7.1 で使用されている方法に従いますが、インキュベーション プロセスはスキップします。 カバースリップから液体を吸引する。各ウェルにDEPC-PBSの4 μLを適用します。 鉗子を使用してカバースリップを持ち上げて反転させ、ガラススライドの上にそっと置きます(ステップ3.2から)。泡を避けてください。 カバースリップの端をシリコンデンタルガムでシールします。 ガムが固まるまで待ちます。ここで一時停止し、4 °Cで一晩スライドを保存することができます。注:他のsmFISHプロトコルは、酸素清掃試薬(例えば、グルコースオキシダーゼ/カタラーゼ)を添加するか、またはフルオロフォアの写真安定性を高めるために市販の抗フェード実装媒体14、26,26を使用することを示唆しています。 8. イメージング 対象領域を見つけるには、位相コントラストイメージングのライブモードを使用します。ステージジョイスティックを操縦することで、ウェル内の視野を変更します。細胞密度が最適な領域を選択します(すなわち、大部分が分離されている多くの細胞があります)。位相コントラストのセルイメージがフォーカスされるように Z フォーカスを調整します。 Cy5 (4-s エクスポージャー)、Cy3 (2-s エクスポージャー)、および位相コントラスト (0.2-s エクスポージャー) の順にスナップショットを作成します。注: Cy3B 色素分子は Cy3 チャネルで画像化され、画像は Cy3 画像と呼ばれます。 手順 8.1 ~ 8.2 を繰り返して、ウェル内の 10 個の異なる領域の画像を取得します。 目的を別の井戸に移動し、ステップ 8.1 ~ 8.3 を繰り返します。 TIFF ファイルとしてイメージをエクスポートします。 (オプション)画像登録のためにCy5チャンネルとCy3チャンネルのカバースリップ面に吸着した画像マルチカラービーズ。 きれいなカバースリップ表面に多色蛍光ビーズ(0.2 μm)の~10 μLを塗布し、10~30分待ちます。PBSを50μL程度で洗浄した後、PBSを5μL程度塗布し、カバースリップをガラススライドで挟みます。密封し、顕微鏡に取付ける。 Cy5 および Cy3 チャネルのイメージビーズ。 9. 画像解析 注: この手順で使用する Matlab コードは、次の GitHub web サイトで入手できます https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020。GitHub フォルダーには、セルのセグメンテーションやスポット識別のパラメーター値など、画像分析に必要なすべてが含まれています。この手順の手順は、マスター スクリプトの “FISHworkflow.m” でさらに説明します。 微生物Tracker27やOufti28などのセルセグメンテーションツールを開き、ロード位相コントラスト画像を開きます。「独立したフレーム」を選択し、「すべてのフレーム」というボタンを押して、セルが識別され、それらの輪郭が計算されるセグメンテーションプロセスを開始します(図3B、C)。C注: これらのソフトウェア パッケージを使用するための詳細なプロトコルは、オンラインで入手できます (例: oufti.org)。 Cy5蛍光画像を微生物TrackerまたはOuftiのspotFinder関数にロードし、「実行」ボタンを押して、2Dガウスフィッティング(図3B、C)に基づいてスポット識別と定量を開始します。CCy3蛍光画像についてこの手順を繰り返し、Cy3チャネルのスポットを解析します。このステップでは、各セル内のスポットのリストが作成され、その強度と座標が含まれます。 (オプション)FISHworkflow.m ファイルで説明されているように、しきい値を使用して、薄暗いスポット (誤検出) を除外します。注: 陰性コントロールの蛍光スポット(MG1655 ΔlacZなど)を調べ、偽陽性を除外するしきい値を決定します。 単一のmRNAのスポット強度を得るためには、時間ゼロで測定されたスポット強度のリスト(IPTGを追加する前)を使用し、2つの混合物成分を持つガウス混合モデルでスポット強度の分布を適合させます。1つのmRNAのスポット強度として、最初のガウス集団(図3D、E,Eの黒線)のピーク位置を取ります。Cy5スポットとCy3スポットに対してこれを別々に行い、単一の5’および3’lacZ mRNAのスポット強度を得る。注: 単一の mRNA のスポット強度は、異なる実験でわずかに異なる可能性があるため、毎回の時間コースの実験でこれを繰り返します。 スポットの蛍光強度を単一の mRNA の強度で分割します (ステップ 9.4 から) スポット内の mRNA の数を取得します。細胞内のスポット強度を合計して、細胞内のmRNAの総数を計算する(図3F)。5′ および 3′ mRNA に対してこれらの計算を個別に実行します。 各時点(例えば図4B)における細胞当たりの平均mRNA数を計算してプロットし、平均mRNAレベルの時間変化から転写およびmRNA分解のin vivo運動論を解析する(図4B)。 転写伸長率を得るためには、5’および3’mRNA信号の初期上昇に対するラインの最小二乗フィッティングを行い、基礎レベルへのインターセプトを同定する(図4B)。これらのインターセプトの差は、RNAPが5’プローブ領域から3’プローブ領域に移動する平均時間を示しています。2つのプローブセット間の距離(2 kb)をこの時間で分割し、転写伸びの平均速度を求めます。 mRNA分解の速度を得るために、指数関数の減衰関数y = A·exp(-t/τ)を5’および3’mRNA信号の最終的な減衰領域に適合させる(例えば、 図4B)。フィッティングパラメータ τは、平均mRNA寿命です。 (オプション)各細胞内のmRNA数の分布(ステップ9.5で計算)に基づいて、遺伝子発現の細胞間変動(例えば、 誘導に対する細胞レベル応答)を解析する。 (オプション)セルの主軸と副軸に沿ったスポット位置に関する情報(ステップ9.2から得た)を用いて、mRNAのローカリゼーションを分析する(図4D、E)。E (オプション)Cy5チャンネルとCy3チャンネルで検出されたスポットの局在を比較して、5′ mRNAと3’mRNAの共同ローカリゼーションを分析します(図5)。 マイクロブトラッカーでスポットファインダーF機能でマルチカラービーズ(ステップ8.6)の画像をロードし、Cy5およびCy3チャンネルでビーズの重心の座標を取得します。図心座標のリストを使用して、アフィン変換行列を計算し、Cy5チャンネルとCy3チャンネルが互いに対してどのようにシフトおよび回転するかを知らせます。 Cy5 および Cy3 FISH イメージにアフィン変換行列を適用して、Cy5 座標の Cy3 イメージを変換します。スポットが別のチャンネルの別のスポットと共局化される場合に分類します。たとえば、図との距離が 150 nm 未満の場合、Cy5 チャネル内のスポットは Cy3 チャネルの別のスポットと共局化されていると見なされます (図 5)。 各時点で、Cy3 スポットと「共局化」に分類される Cy5 スポットの数を分析します。また、共局化されたスポットの強度を解析する(図5)。
Representative Results
図 3 は、この smFISH プロトコルの代表的なイメージを示しています。完全視野( 材料表で詳述した顕微鏡設定を用いた86.7 μm x 66.0 μm)は、フィールド全体に分散した500 個の大腸菌 細胞を示しています(図3A)。細胞の密度がこの画像に示されているものよりはるかに高い場合、細胞が互いに接触したときにセグメンテーションアルゴリズムが個々の細胞を確実に識別しなくなるため、細胞の自動分割が困難になります。一つは、視野の細胞の最適な密度を達成するために、表面の付着に使用される細胞の濃度とインキュベーション時間(ステップ5.1)を調整する必要があります。 位相コントラスト画像における細胞の形態は、セグメンテーション目的で生細胞の形態と同等であり続けるべきである(図3A-C)。細胞が過剰透過化されると、細胞の形態が変化する(「幽霊」のように)補助図 1)。その場合、ステップ5.3で70%エタノール処理の持続時間を短縮してもよい。 誘導前の平均lacZ発現量はセル当たり約0.03 mRNAであり、以前の報告15,,30と一致した。また、誘導前のlacZ mRNAスポット強度の分布は、高強度のスポットの存在により正規分布やポアソン分布とうまく適合しなかった(図3D、E)。Eこれは、抑圧された状態で検出されたスポットのほとんどが単一のlacZ mRNAを表すが、スポットの少数の集団には複数のlacZ mRNAが含まれていることを示唆している。単一のlacZ mRNAで母集団を分離するために、我々は2つの混合成分(図3D、Eのインセット)を含Eむガウス混合物モデルを使用した。次いで、第1のガウシアンの平均を単一のmRNAスポットの平均強度(例えば、図3Dの黒曲線のピーク)としてとり、スポット強度をmRNAの数に変換するために使用され、タイムコース実験で検出された任意のスポットに対して。セル内の mRNA の総数を計算するために、正規化されたスポット強度を各セル (図 3F)19で合計した。 lacZ mRNAの発現レベルが低いと、細胞内で空間的に分離された1つまたは2つの回折限定のlacZ mRNAスポットがある。したがって、これらのスポットの画像は、その強度と局在性のために2Dガウスフィッティングによって分析することができます。 発現レベルが高い場合、細胞内でスポットが互いに重なるような、2Dガウス継手は確実な定量化を行わない。その場合、mRNAレベルは、単一mRNA19の平均強度を有する細胞内の全バックグラウンド減の蛍光シグナルを除いて算出すべきである。 lacZの発現が誘導されると、5’lacZ mRNAのシグナルが最初に増加し、3’lacZ mRNAのシグナルが後で増加する(lacZlacZ図4B)。lacZの発現が抑圧されると、5’および3’の両方のlacZ mRNAシグナルが減少し、間に若干の遅延が生じます(図4B)。転写伸長率を得るために、5’と3’の信号の上昇は最初に線(図4B)に適合し、Xインターセプトの差は、RnaPが2つのプローブ領域間の距離を移動する時間(2,000 nt)として取られます。転写伸長率は、各時間経過実験から測定することができ、標準偏差は実験重複から計算することができる。転写伸長の平均率は、実験条件19の下で15-30 nt/sであった。 さらに、mRNA分解速度(平均mRNA寿命の逆)は、指数関数を有する崩壊領域を適合させることによって得られた(図4B)。当社のタイムコースデータには、転写中および転写後のmRNA分解が含まれています31.3′ mRNAが減衰し始めた後の時点(t > 6分)に適合し、放出されたmRNAの劣化を調査します。5’または 3’lacZ mRNA19の平均寿命として〜90 sを得た。 転写開始率は、誘導後の5’シグナル上昇の傾き(図4B、青色)から、または定常状態(分解率で割った開始率)における平均mRNA数から計算することができる。さらに、早期転写終了の確率は、3’シグナル増加の傾きと5’シグナル増加32の傾きとの間の比を取ることによって、または3’と5’mRNA領域の定常レベル間の比を取ることによって推定することができる。 smFISHは単細胞技術であるため、転写における細胞間変動を解析することができます。例えば、IPTGが追加された後 にlacZ mRNAを発現する細胞の割合を分析することができる(図4C)。また、誘導後にmRNAの局在化が変化するかどうかにも対処できます。我々は、5’及び 3’lacZ mRNAスポットが細胞の中心から離れてわずかに外側に移動することを観察した(図4D,E)、前回の報告33と一致する。 最後に、5’と3’mRNAスポット間の共局在化の分析は有益であり得る(図5A)。例えば、抑圧された状態(時間ゼロ)では、5’mRNAスポットの約25%が3’mRNAスポットと共局化される。t = 1 minでは、多くの遺伝子遺伝子座が5’mRNA合成を有するが、まだ3’mRNA合成されていないので、5’mRNAスポットのほとんどは3’mRNAシグナルなしでそれ自体である(すなわち、共局在化の確率が低い)。しかし、3’mRNAが出現すると(すなわち、t= 2分)、共局在化の確率が高くなる(図5A、Bの紫色のB矢印)。この時点は、共局在化が頻繁になるとき、転写伸びの速度に依存する。この時点で検出された各共局在化スポット内の5’および3’lacZ mRNA数の2次元密度プロットを使用して、lacZ遺伝子上のRNAPsの密度を推測することができる(図5C)。既に報告された19の報告によると、このプロットの5’mRNAの数は、lacZ発現が1mM IPTGによって誘導されると、lacZ遺伝子座の大部分がDNA上に10未満のRNAPを有することを示している。さらに、このプロットの3’mRNA数は、RNAPs34のクラスタリングに関連しています。3’mRNAの数が1に近いという事実は、およそ1つのRNAPだけが3’プローブ領域に入ることを意味します。これは、lacZ遺伝子のRNAPが、クラスター(または「コンボイ」)を形成するのではなく、空間的に分離されていることを示唆している。 図1:関心のあるmRNAに対するsmFISHプローブの設計 (A) タイル方式。短いDNAオリゴヌクレオチドの配列(長さは20bp程度)は、それらが目的のmRNAをカバーできるように選択される。オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光色素分子で標識されています。(B) 配列メソッド。タンデム配列の非コード配列(例えば、「lacO 配列」)は、目的のmRNAに転写的に融合される。蛍光標識されたプローブは、反復ユニットに相補的に(例えば、17bpの長さのlacOプローブ)mRNAのシグナルを増幅するために使用される。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図2:各ステップのsmFISH実験手順と時間持続時間の概略図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図3:smFISH画像解析。(A-C)野生型Eにおける5’lacZ mRNA(赤)および3’lacZ mRNA(緑色)のsmFISH顕微鏡画像。 0.2%グリセロール、0.1%カザミノ酸、および 1 mg/L チアミンを 30 °Cで補充した M9 の最小培地で成長した大腸菌(MG1655) t.05 mM IPTG で t = 0 mM IPTG を有する t = 0 mM IPTG と 500 mmm のグルコース = 500 mme = 500 mme の抑制値を有する t = 3 分からのサンプルの代表的な画像lacZlacZA位相コントラストおよびCy5(5’lacZ mRNA、赤色lacZ)およびCy3(3’lacZ mRNA、緑色lacZ)の2つの蛍光画像を擬似着色で重ねた。画像は86.7 μm x 66.0 μmの全フィールドを示しています。スケールバー、5 μm。(B) (A)の小さな領域(黄色のボックス)のズームインバージョン。細胞の輪郭は白で示され、画像解析から特定された蛍光スポットは赤い点で示されています。スケールバー、1 μm。(C)高発現条件下での細胞の外形および蛍光スポットの検出(t =1 mM IPTGによる誘導後4分)。スケールバー、1 μm。(D-E)IPTGを添加する前に測定された5’および3’mRNAスポット強度の分布(抑圧された状態)。ヒストグラムは、ガウス混合モデルからの平均値を持つ 2 つのガウス関数 (黒と灰色) で示されます。インセットは、ガウス混合モデルおよび実験的に測定されたmRNAスポット強度(n = 5’mRNAの場合は1040、3’mRNAの場合は680)から生成された乱数の分位定量プロットを示す。(F)パネル(B)で指し示された個々のセルに関して得られる情報。与えられたセル(i)について、Cy5およびCy3チャネルでスポットを同定し、その強度(I)およびセルの短軸と長い軸に沿った座標(d,l)を2Dガウスフィッティングから定量した。 l正常化後のスポット強度を合計すると、このセル内に5’または3’mRNAの総数が得られた。また、異なるチャネルからのスポット間の共局在化は、図5に示す例のように分析できます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図4:転写およびmRNA分解のインビボ動態の解析。(A) 経時のlacZ mRNAレベルの変化を測定する2色smFISH実験の模式図および代表的な画像。赤と緑の点線は、大腸菌中のlacZ mRNAの1kb-long 5’および3’mRNA領域にそれぞれハイブリダイズするCy5またはCy3B標識オリゴヌクレオチドプローブを示す。また、t = 0 minで0.2 mM IPTGを有する誘導後の示された時点での位相コントラスト画像を有する2つの蛍光画像のオーバーレイも示されている。転写は、t=1.5分で500 mMのグルコースで抑圧された。スケールバー、1 μm。この図は、Kim et al19.19から変更されています。(B)5’および3’lacZ mRNA数を時間の経過とともに、パネル(A)に記載された実験中に。B lacZエラー バーは、ブートストラップされた SOEM です。1つの時点で少なくとも1,200個の細胞を分析した。5’および3’mRNA信号の最初の上昇はライン(青)と合っていた。X-インターセプトの差は1.93分で、転写伸長率は17.3nt/sの平均値となった。5’および3’mRNA信号の最終的な減衰は指数関数(灰色)と適合した。適合パラメータは、平均mRNA寿命が5’mRNAの場合は1.52分、3’mRNAで1.66分であることを示しています。(C)(A)に記載された実験中に1つ以上のlacZ mRNAスポットを有する細胞の割合。Cエラー バーは、ブートストラップされた SOEM です。(D) セルの短軸に沿ったスポットの局在化。短い軸(d)に沿って位置を細胞の半分の幅(w)で割ることによって、スポットの膜への近接性を定量化することができます。(E)(A)に記載された実験中に細胞の短軸に沿って5’および3’lacZ mRNAスポットの局在化の変化。E lacZこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図5:5’および3’mRNAスポットの共局在化の分析。(A)誘導後の5’と3’mRNAスポット間の期待される共局在化を示す回路図。3’mRNAが作られると、5’mRNAスポットが3’mRNAスポットと共局化される確率が高くなる(紫色の矢印)。(B)1 mM IPTGによる誘導後の共局化の確率。紫色の矢印は、パネル(A)の回路図に従って、最初に共局在化の確率が頻繁になる時点を示します。(C)1 mM IPTG(合計841スポット)で誘導後にt = 2分で検出された共局在スポット内の5’および3’lacZ mRNAの数。灰色のドットは、個々の共局化されたスポットを表し、赤い点はビン分割されたデータの平均を表します。誤差範囲は SEM です。灰色の濃淡は、グラフの特定の領域内のポイントの密度を示します。点線は勾配 1 を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 図6:プローブハイブリダイゼーション条件の最適化 2種類のサンプルを使用しました: 図3 に記載されているように成長したMG1655細胞は、誘導不能(青色)のまま、または0.5 mM IPTGで20分間(赤)で処理しました。プローブハイブリダイゼーション溶液は、異なる濃度のプローブ (lacZ 領域全体をタイリングする合計72個のCy5結合プローブ)およびホルムアミドで作られた。ホルムアミド濃度もそれに応じてプレハイブリダイゼーション溶液および洗浄液で調整した。「プローブなし」(灰色線)は、ハイブリダイゼーション工程中にプローブなしで処理したIPTG付加細胞の蛍光レベルを示す。細胞面積(AU)によって正規化された平均蛍光強度は、300〜800細胞から計算した。エラー バーは、ブートストラップされた SOEM です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 補助図1: 透過性の過剰化による歪んだ細胞形態。位相コントラスト(グレースケール)のオーバーレイ 、5’lacZ mRNA(Cy5、赤色)、および 3’lacZ mRNA(Cy3、緑色)の画像は、誘導後5分のMG1655細胞のIPTGを有する。(A)正常な形態を欠いている正常細胞と過度に透過性の細胞(ピンクの矢印で示される)の混合物を示す例。(B) 「幽霊」細胞が集まる例。スケールバー= 1 μm. このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。 デPCウォーター 0.1%のDEPCを超純水に加え、37°Cオーブンでボトル(覆われた)を一晩インキュベートし、翌日オートクレーブします。 デPC PBS (10X) 次の内容を混ぜます。 80g ナクル(決勝1.37M) 2 g KCl(決勝27mM) 14.2 g Na2HPO4 (最終100mM) 2.7グラム KH2PO4 (最終20mM) 超純水~1L ガラス瓶にフィルター(0.22 μm)します。 0.1PCを追加し、DEPC水の指示に従ってください。 1X溶液を作るために、DEPC水で10倍希釈します。 1M DEPC リン酸ナトリウムバッファー、 pH 7.4 次の内容を混ぜます。 115g Na2HPO4 22.8 g NaH2PO4 超純水を1 Lへ ガラス瓶にフィルター(0.22 μm)します。 0.1PCを追加し、DEPC水の指示に従ってください。 4X固定溶液(16%ホルムアルデヒド) 5 mL 20%ホルムアルデヒド 500 μL DEPC水 750 μL 1M DEPC リン酸ナトリウムバッファー、 pH 7.4 4°Cで2~4週間保存します。 注意:ホルムアルデヒドは有毒です。このソリューションを作る際は手袋を着用し、ヒュームフードを使用してください。 洗浄液 次の内容を混ぜます。 10 mL フォルパミド(最終25%) 4 mL 20X SSC(最終2倍) DEPC水を40 mLに充填 フィルター(0.22 μm)、4 °Cで保管 注意:ホルムアミドは有毒です。このソリューションを作る際は手袋を着用し、ヒュームフードを使用してください。 プレハイブリダイゼーションソリューション 200 μL フォルパミド(最終20%) 100 μL 20X SSC(最終2倍) 10 μL 100X VRC(最終1X) 25 μL 4% (w/v) BSA (最終 0.1%) 685 μL DEPC水 注:10 μLを取り出す前にVRCストックをボルテックスします。 注意:ホルムアミドは有毒であり、既知のテラトゲンである。手袋を着用し、ヒュームフードの下でそれを処理します。 プローブハイブリダイゼーションソリューション 200 μL フォルパミド(最終20%) 100 μL 20X SSC(最終2倍) 10 μL 100X VRC(最終1X) 25 μL 4% (w/v) BSA (最終 0.1%) 10 μL 40 mg/mL 大腸菌 tRNA (最終 0.4 mg/mL) 200 μL 50% デキストラン硫酸 (最終 10%) x μL 5′ mRNA プローブセット(ステップ 1.12 から)から最終 4 nM まで。 y μL 3′ mRNA プローブセット(ステップ 1.12 から)から最終 4 nM まで。 – 総容積1 mLを作るためにDEPC水 注:最後にデキストラン硫酸を追加します。それは非常に粘性があるので、50%の在庫から200 μLを取り出す前に、ピペットの先端の端を切ります。デキストラン硫酸塩を添加した後、ピペットを上下にして溶液を均質化する。 表1:使用するソリューションのレシピ。
Discussion
ここでは、大腸菌のmRNA運動を測定するためのsmFISHプロトコルを発表しました。以前に公開された細菌23のsmFISHプロトコルでは、細胞は、イメージングの準備ができるまで、プロトコルの最後までチューブに保持されていました。カバースリップ表面23上の蛍光プローブの非特異的結合の最小など多くの利点を有するが、時間経過実験から多くのサンプルがある場合には、これらのプロトコルに従うことは困難である。まず、比較的大量の細胞 (>1 mL) をサンプリングし、固定前に収穫する必要があります。第二に、細胞サンプルは、溶液を交換し、ハイブリダイゼーションステップ後に洗浄するために複数回遠心分離する必要があります。我々のプロトコルでは、培養液の小さな容積(<1 mL)が1.5mLチューブの固定溶液と直接混合され、サンプリングの瞬間に細胞状態を素早く「凍結」するのに役立ちます。また、細胞は手順全体を通して表面に付着したままで、異なる溶液は、真空ろ過システムで液体を吸引し、マルチチャネルピペットで一度に溶液滴を適用することによって迅速に交換することができます。この違いは、多数のサンプルを一度に処理する必要がある場合に、プロトコルを非常に有利にします。プロトコルを使用すると、12~48個のサンプルを同時に処理でき、FISHの手順全体を約8時間以内に完了できます(図2)。例として大腸菌におけるlacZの発現を例に用いたが、このプロトコルは、以下に考察する様々な遺伝子および細菌種に広く適用可能である。
異なる遺伝子については、最初に考慮すべき事項はsmFISHプローブです。1つは、目的のmRNAをタイルするオリゴヌクレオチドプローブを設計してもよい(図1A)13.この「タイリング」プローブアプローチでは、各プローブは~20塩基長であり、5’または3’末流部で蛍光色素で標識される。この戦略は、遺伝子操作が必要とされていないので便利です。あるいは、タンデム反復~20bp配列は、ゲノム配列に対して異質(例えば、コーロバクター三日月14日のlacO配列)、目的の遺伝子の非翻訳領域に挿入され、かつ、反復単位に相補的な単一のプローブがmRNA(「配列」アプローチ)に標識するために使用される。図1B)。いずれの場合も、複数の蛍光体がmRNAを飾り、細胞内に非特異的に結合した単一のプローブから容易に分化できる増幅蛍光シグナルを与える。
「タイル」または「アレイ」アプローチを選択するかどうかは、陰性制御に依存し、プローブの非特異的結合が標的mRNAを欠いているために試験されるサンプルである。タイリングプローブ(図1A)の場合、対象遺伝子または条件のない変異株は、遺伝子が転写されない(例えば 、lacZの抑制)プローブの非特異的結合を試験するための陰性制御として機能し得る。アレイベースのsmFISH(図1B)では、プローブの結合部位が含まれていないため、アレイを欠いた野生型のひずみは負のコントロールとして機能します。
最適なハイブリダイゼーション条件は、プローブ配列、さらにはフルオロフォア色素の選択に依存する可能性があります。37°Cのハイブリダイゼーション温度を保ち、ハイブリダイゼーション液中のプローブセットとフォルミドの異なる濃度をテストすることで、lacZプローブセットのハイブリダイゼーション条件を最適化しました。より高濃度のホルムアミドは、非特異的および特異的結合の両方を減少させる傾向がある26,,35.ハイブリダイゼーション時間と温度を同じに保ちながら、ハイブリダイゼーションとその洗浄条件を体系的に変更することをおすすめします。条件がより厳しくなるにつれて、非特異的および特異的結合の両方が減少する(図6)。非特異的結合が許容可能なしきい値を下回り始めるポイントを見つけることが重要です。たとえば、プローブなしで得られた信号レベル(「プローブなし」)をしきい値として使用しました(図6)。
mRNAの2つの別個の領域を標識する2色smFISH法は、長い遺伝子に限定される。転写伸びの速度を測定するために 、lacZ が長く(3075 bp)であり、その発現がIPTGによって誘導され得るという事実を利用した。遺伝子が短いとき、2つのタイリングプローブセット(5’と3’の端の近く)を設計し、5′ と 3′ mRNA 領域の出現の間の時間遅延を解決することは困難です。この場合、smFISHによって安定状態で新生mRNAを数え、転写率がフィッティングパラメータ20としてある解析モデルを用いて分布を分析することができる。また、目的の遺伝子が誘導できない場合、リフィンピシンを有する細胞を時間0で治療し、5’および3’mRNAサブ領域の時間変化を測定することができる。5’mRNAシグナルの減少から3’mRNAシグナルのそれへの遅延は、次いで、31以前に行われた転写伸びの速度を計算するために使用することができる。
最後に、smFISHプロトコルは汎用性があり、他のラベリングスキームと組み合わせることができます。以前は、DNAの遺伝子座をmRNA FISHとDNA FISH14または蛍光レポーターオペレータシステム20と組み合わせることにより、mRNAと共に可視化した。タンパク質産物は、mRNA FISH14,36,36と共に免疫蛍光を行うことによって可視化され得る。また、3次元超解像顕微鏡37と組み合わせることで、3次元38、39の全ての3次元でmRNAを可視化することができる。39
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロトコルは、ハワード・ヒューズ医学研究所とイェール大学微生物科学研究所のクリスティーン・ジェイコブス・ワーグナー博士の研究室での博士研究員の間にS.K.によって開発されました。ジェイコブス・ワーグナー博士と研究室のメンバーに対し、メソッド開発中の様々なインプットと、原稿の批判的な読み取りについてローラ・トロイヤーに感謝します。S.K.はサール・スカラーズ・プログラムからの支援を認める。K.V.は、イリノイ大学のジェームズ・スカラー・プレブル・リサーチ・アワードの支援を認めています。
Materials
| Bacterial strain | |||
| Escherichia coli MG1655 | |||
| Chemicals, peptides, and others | |||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
| Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
| Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
| Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
| Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
| Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
| Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
| Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
| FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
| Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
| Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
| Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
| Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
| 2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
| Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
| Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
| Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
| sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
| Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
| Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
| TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
| Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
| Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
| Equipment | |||
| C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
| Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
| Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
| Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
| Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
| Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
| Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
| UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
| Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
| Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
| Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
| Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
| Tools | |||
| 1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
| 1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
| Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
| Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
| Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
| Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Gloves | Microflex | MK-296-M | |
| Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
| Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
| Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
| Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Software and algorithms | |||
| MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
| MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
| https://oufti.org/ | |||
| Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
| Microscope | |||
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
| Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
| Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
| Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
| Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
| Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
| Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
| Probe sequence | |||
| DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
| lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
| lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
| lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
| lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
| lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
| lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
| lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
| lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
| lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
| lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
| lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
| lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
| lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
| lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
| lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
| lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
| lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
| lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
| lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
| lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
| lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
| lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
| lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
| lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
| lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
| lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
| lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
| lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
| lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
| lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
| lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
| lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
| lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
| lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
| lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
| lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
| lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
| lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
| lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
| lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
| lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
| lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
| lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
| lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
| lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
| lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
| lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
| lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
| lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
| lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
| lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
| lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
| lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
| lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
| lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
| lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
| lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
| lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
| lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
| lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
| lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
| lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
| lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
| lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
| lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
| lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
| lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
| lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
| lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA | |
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Cite This Article
Kim, S., Vaidya, K. Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (161), e61520, doi:10.3791/61520 (2020).