Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

1. SMFISH problarının hazırlanması NOT: SMFISH problarını tek bir florofor ile etiketlemek için, NHS ester kimyası21’edayalı nükleik asit oligonükleotidlerin etiketletilmesi için standart bir protokol izleyin. Tasarım smFISH probları. İlgi geni için “fayans” probları mı yoksa “dizi” probları mı(Şekil 1)kullanacağınıza karar verin. Kararın nasıl verilebildiğini anlatan Tartışma bölümüne bakın. “Döşeme” probları için(Şekil 1A),çevrimiçi bir sonda tasarımcısı aracı kullanın (örn. Malzeme Tablosu’nabakın). “Dizi” sondaları(Şekil 1B)için, sonda sırasının diğer mRNA dizilerine tamamlayıcı olmadığından emin olmak için blast sırasını gerçekleştirin. lacZ mRNA transkripsiyon ve bozulma kinetik çalışma için, 24 problar, her bir set lacZ (3.072 bp)19ilk ve son 1 kb bölgeleri kapsayan iki set kullanın.NOT: Bu sonda setleri, bundan sonra sırasıyla “5′ mRNA sondası” ve “3′ mRNA sondası” olarak adlandırılır. Bu probların dizileri Malzeme Tablosu’ndalistelenmiştir. 5′ sonunda bir C6 amino bağlayıcı ile DNA oligonükleotidolarak Sipariş sonda dizileri. Suda ayrı ayrı probları 1 mM’ye çözün. “5′ mRNA prob” ve “3′ mRNA prob” kümeleri için equimolar miktarda probları birleştirin. Örneğin, lacZiçin ayarlanan 5′ mRNA prob için, her probun 20 μL’sini (kümedeki toplam 24 prob türü) birleştirir. Konjugasyon reaksiyonunu inhibe eden primer ve sekonder aminlerin (Tris, glisin ve amonyum tuzları gibi) kontaminasyonunu gidermek için kombine probların22’sini etanol çökeltme gerçekleştirin. Sonunda, DNA peletini 100 μL suda çözün (bir sonda setinde ~4,5 mM DNA elde edin).NOT: Problar üretici tarafından standart tuzdan arındırma geçirmiş olsa bile bu adım önerilir. Standart filtre tabanlı arınma, etanol yağışının yerine ve ek olarak çalışabilir. Tek fonksiyonlu NHS ester moiety ile iki spectrally farklı floropores seçin, böyle 5′ ve 3′ mRNA prob setleri farklı olarak etiketlenebilir. Örneğin, Cy5 NHS esterini 5′ mRNA probları için, Cy3B NHS esterini ise 3′ mRNA probları için hazırlayın. Susuz DMSO’daki her bir florofor türünü 20 mg/mL ‘ye (~25 mM) kadar eritin. Her etiketleme reaksiyonundan hemen önce 0,1 M sodyum bikarbonat (pH 8,5) hazırlayın. Uzun süre havaya maruz kalmak pH’ını düşürür ve etiketleme verimliliğini azaltır. Konjugasyon reaksiyonu için aşağıdakileri birleştirin: Cy5 florofor stokunun 15 0L’si (Adım 1,5’ten), 4’l 5′ mRNA prob seti (Adım 1.4’ten), 75 μL sodyum bikarbonat (Adım 1.6’dan itibaren) ve 7°L su. Alüminyum folyo ile tüp sarın ve 3-6 saat oda sıcaklığında sallayın.NOT: Daha uzun kuluçka mutlaka daha fazla etiketleme verimliliği neden olmaz. Ayrıca, bileşenlerin konsantrasyonları korunursa reaksiyon yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. 3′ mRNA prob seti ve buna karşılık gelen florofor (yani Cy3B NHS-ester) için yukarıdaki adımı tekrarlayın. Reaksiyona girilmemiş boya moleküllerini çıkarmak için etanol çökeltisi22 yapın. Pelleti ~ 50 μL TE tampon (10mM Tris-HCl pH 8.0 1mM EDTA ile) eritin. UV-Vis spektrometresi kullanarak DNA ve florofor konsantrasyonlarını tahmin edin. Emiciliği 260 nm ve 559 nm (Cy3B) veya 649 nm (Cy5) olarak ölçün. Numune doğru bir ölçüm elde edemeyecek kadar konsantre yse, numunenin 1 00L’sini 10 μL’ye seyreltin. Emiciliği konsantrasyona dönüştürün:εDNA = 0.2 μM-1 (20-nt tek iplikçikli DNA için), εCy5 = 0.25 μM-1ve εCy3B = 0.13 μM-1NOT: [DNA] çözelti içinde toplam probların konsantrasyonudur. Bireysel probların konsantrasyonu yaklaşık 24 kat daha düşüktür. Toplam probların konsantrasyonu bu noktadan itibaren “sonda konsantrasyonları” olarak kullanılacaktır. [DNA] ve [boya] arasındaki oran 1 ise, aşağıdaki HPLC adımı23atlanabilir ve örnek TE tamponunda son 4-5 μM’ye seyreltilmelidir. (Tavsiye edilir) Etiketli probları etiketlenmemiş problardan ve serbest boyalardan HPLC kullanarak arındırın.NOT: Bu ek arıtma adımı numune kaybına yol açsa da, akış aşağı uygulamaları için yararlıdır. Etiketlenmemiş DNA sondalarının çıkarılması mRNA hedeflerinden gelen floresan sinyalini artıracak ve tepkisiz boyaların çıkarılması arka plan floresansını azaltacaktır. Standart analitik C18 sütunu ile HPLC hazırlayın, tampon A olarak 0.1 M triethylamonnium asetat (TEAA), tampon B olarak asetonitril. 0,1 M TEAA yapmak için örneğe (Adım 1,9’dan) 1 M TEAA ekleyin. Degrade programını aşağıdaki gibi ayarlayın: 0-5 dk %0 B, 5-35 dk %0-30 doğrusal degrade b, 35-37 dk -100 doğrusal degradeli B ve 37-40 dk %0 B. Akış hızını 0,1 mL/dk’da tutun ve 260 ve 649 nm (Cy5 etiketli numuneler için) veya 260 ve 559 nm (Cy3B etiketli numuneler için) de kromatogramları kaydedin. Hem DNA hem de florofor kanallarında absorbans arttığında eluted örnek toplamak. Eluted numuneyi vakum konsantratörü kullanarak yoğunlaştırın ve 50-100 μL TE tamponunda peleti yeniden askıya alın. UV-Vis spektrometresi kullanarak DNA ve florofor konsantrasyonunun kontrol edin (Bkz. Adım 1.10). Seyreltik, gerekirse, 4-5 μM civarında son konsantrasyon yapmak için. 2. Çözümlerin hazırlanması Depc ile işlenmiş su ve tamponlar büyük hacimli hazırlayın(Tablo 1). Bu çözümler oda sıcaklığında bir yıldan fazla sürebilir. 4x sabitleme çözeltisi ve yıkama çözeltisi hazırlayın (Tablo 1). Ön hibridizasyon çözümve prob hibridizasyon çözeltisi(Tablo 1)hazırlayın. Adım 5.1 veya Step 6.1’de kuluçka sırasında prob hibridizasyon çözeltisini hazırlayın ve ışığa maruz kalmamayı en aza indirmek için çözeltiyi 20-40 dakika boyunca 37 °C’lik bir tezgah sallayıcıda saklayın.NOT: Formamid, SSC ve probu konsantrasyonları, gerçek sinyali maksimize ederken arka plan floresansını en aza indirmek için lacZ prob setleri için optimize edildi. Bu konsantrasyonların farklı uygulamalar için nasıl değiştirilebildiğini hakkında ayrıntılar için Tartışma bölümüne bakın. 3. Kapak ve cam kaydırakların hazırlanması Kapakları ve cam slaytları temizleyin. Tek tek kapakları ve slaytları bir Coplin kavanozuna forceps kullanarak yerleştirin. Kapak ve slaytların birbirinden ayrıldığından ve birbirine dokunmadığından emin olun. Kavanozu 0 etanolile doldurun ve kapağıkapatın. Bir su banyosu ultrasonik temizleyici ve sonicate 15-20 dakika için kavanoz yerleştirin.NOT: Su banyosu sonicator için ısıtıcı işlevini kapatmak için tavsiye edilir. Etanol dökün ve ultra saf su ile yıkayın 3-4x. Doğrudan su arıtma makinesinden akan suyu kullanın. Kavanozdan su dökün ve% 70 etanol ile doldurun. Kapağıkapatın ve 15-20 dakika sonication gerçekleştirmek ve ultrasaf su ile yıkayın. 15-20 dakika ultrasaf su ve sonicate ile kavanoz doldurun.NOT: Kapaklar ve cam kaydıralar bir gecede ultra saf su ile dolu Coplin kavanozunda saklanabilir. Coplin kavanozundan temiz çifenekler kullanarak bir kaydırak veya kapak çıktın ve N2 gazı kullanarak üfleyin. Kalan slaytlar ve kapaklar için bunu tekrarlayın. Kurutulmuş slaytları Adım 7.5’te kullanıma kadar temiz bir saklama kutusuna yerleştirin. Kurutulmuş kapakları, kalan işlemde “hazne” görevi gören 1.000 μL’lik boş bir pipet ucu kutusuna yerleştirin. Hidrofobik bir marker kullanarak, pipet ucu kutusundaki dairesel delikleri takiben kapaklara daireler çizin. Bu daireler (çapı ~ 0.5 cm) “kuyu” olarak hizmet edecektir. Markertamamen kurutulması için en az 5-10 dakika bekleyin.NOT: Bahşiş kutusunun kapağını her zaman kapalı tutun. Her kuyuya %0,1 poli-L-l-lizin 20-l damla uygulayın. Oda sıcaklığında 10-50 dakika kuluçka.NOT: Bu hacmi kuyu büyüklüğüne göre ayarlayın. Çözümün kuyu alanını tamamen kapsadığından emin olun. Daha uzun kuluçka için, buharlaşma önlemek için dikkatli olun. Kuluçkadan sonra yüzeye dokunmadan poli-L-lizin aspirasyon poli-L-lizin kazıyacak gibi. Daha sonra poli-L-lizin işlenmiş kuyulara bir damla (~20°L) DEPC suyu uygulayın. Adım 5.1 kadar buharlaşmayı önlemek için “hazne” kapağını kapatın. 4. Zaman-ders deneyi ve örnek fiksasyonu 250 mL’lik bir şişede ~20 mL sıvı kültüründe E. coli hücrelerini büyütün. Şişeyi su banyosu shaker’da (30 °C) tutun ve sallamaya devam edin. Sadece numune alırken çalkalayıcıyı durdurun.NOT: Bu yazıda sunulan sonuçlar MG1655 hücreleri M9 minimal ortamda% 0.2 gliserol ile takviye olarak yetiştirilen elde edilir, 0.1% casamino asitler, ve 1 mg / L tiamin üstel büyüme fazı (OD600~ 0.2). Boş bir 1,5 mL tüpe 4x sabitleme çözeltisinin 250 μL’sini ekleyin. Tekrarlayın ve alınacak zaman noktaları kadar birden fazla tüp hazırlayın. Tüpleri zaman noktası numaralarıyla etiketleyin ve oda sıcaklığında tutun. Bir zaman kursu deneyine başlamadan önce 750 μL hücre kültürü (OD600~0,2) alın. Kültürü “sıfır zaman” (Adım 4.2’den) için işaretlenmiş bir tüpe ekleyin. Hücreleri sabitleme solüsyonuyla karıştırmak için tüpü nazikçe ters çevirin.NOT: Hücrelerde karıştırmak, girdap lamak veya “kaba olmak” için pipetleri yukarı ve aşağı yapmayın. Bu örnek bastırılmış durumu temsil eder ve tek bir mRNA’nın floresan yoğunluğunu hesaplamak için denetim olarak kullanılır (Bkz. Adım 9.4). LacZ ekspresyonu indüklemek için sıvı kültürüne 0,02-1 mM izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ekleyin. Bu noktadabir zamanlayıcı başlatın (t = 0 dk) ve belirli bir zaman aralığında (örneğin, her 1 dakika) örnek o andan itibaren. Örnekleme için Adım 4.3’u tekrarlayın. LacZ ekspresyonunu bastırmak için zaman-kurs deneyi sırasında belirli bir zamanda (örn. t = 1,5 dk) 5 mM ortonitropheynl-β-D-fucopyranoside (ONPF) veya 500 mM glikoz24 ekleyin. Yeniden baskıdan sonra, mRNA bozulmasını izlemek için kültürleri (Adım 4.3) örneklemeye devam edin.NOT: Baskı da ~ 400 μg/mL rifampisin, bir transkripsiyon inisiyasyon inhibitörü25ile yapılabilir. Fiksasyon için, oda sıcaklığında örneklenmiş hücreleri içeren tüpleri 15 dakika boyunca kuluçkaya yatırın, ardından 30 dakika buzda kuluçka. Fiksatifleri gidermek için tüpleri 4500 x g’de oda sıcaklığında 4 dk santrifüj edin. Bir pipet ile supernatant çıkarın.NOT: Güvenlik protokolünü izleyerek formaldehiti ayrı bir atık kabına attığından emin olun. 1 mL DEPC-PBS ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın. Tekrar santrifüj ve yeniden süspansiyon 2x daha fazla kez.NOT: Sabit hücreler kırılgandır ve nazik bir tedaviye ihtiyaç duyarlar. Dikkatle pelet yeniden askıya ve kabarcıklar kaçının. Son yıkama adımından sonra ~ 30 μL DEPC-PBS’deki hücreleri yeniden askıya alın. 5. Hücre zarlarının permeabilizasyonu Kapak kayma (~ 30 μL kuyu başına) farklı kuyulara her zaman noktası örnek uygulayın. Hücrelerin yüzeye yapışması için oda sıcaklığında 10-30 dakika bekleyin. Kuyular arasında sıvı damla birleştirme kaçının. Bağlanmamış hücreleri durulamak için sıvıyı aspire edin ve her kuyuya ~20°L DEPC PBS uygulayın. Birkaç dakika içinde DEPC PBS aspire. 4 dakika boyunca her kuyuya etanol 15 μL uygulayarak hücre zarlarını permeabilize edin. 4 dakika sonra etanol aspire ve kuyular tamamen kuru olduğundan emin olun.NOT: Etanol tedavisinin 4 dakika süreyle sınırlandırılması çok önemlidir. Daha uzun tedavi aşırı permeabilizasyon alacaktır. Yıkama çözeltisinin 30 μL’sini her kuyuya uygulayın. 6. Prob hibridizasyonu Yıkama çözeltisini her kuyudan aspire edin. Her kuyuya 30 μL ön hibridizasyon çözeltisi uygulayın. 37 °C fırında 30 dk için hazne kuluçkaya yatırın.NOT: Nem sağlamak için haznenin dibine ~50 mL su ekleyin. Her kuyudan ön hibridizasyon çözümaspire. Prob hibridizasyon çözeltisinin ~30 μL’sini her kuyuya uygulayın. 37 °C fırında 2 saat boyunca odayı alüminyum folyo ile kaplayın ve kuluçkaya yatırın.NOT: Bu adımdan önce prob hibridizasyon çözeltisinin 37 °C tezgah sallayıcıda olduğundan emin olun. Kuyular arasında sıvıların birleştirilmesinden kaçının. Gerekirse her kuyuya çözeltinin daha küçük bir hacmi uygulayın. 7. Hibritizasyon sonrası yıkama ve görüntüleme ye hazırlık Çok kanallı bir pipet kullanarak, yıkama çözeltisinin ~30 μL’sini her bir kuyuya aynı anda uygulayın. Aspire ve yıkama 3-5x kez tekrarlayın. 37 °C fırında 15-30 dk için hazneyi kuluçkaya yatırın. Adım 7.1’i iki kez daha tekrarlayın. DePC-PBS ile her bir kuyuda 5x kez yıkayın. Adım 7.1’de kullanılan yöntemi izleyin, ancak kuluçka işlemini atlayın. Örtüden sıvıyı aspire edin. Her kuyuya 4 μL DEPC-PBS uygulayın. Forseps kullanarak, kapağı kaldırın ve çevirin ve yavaşça bir cam slayt üzerine yerleştirin (Adım 3.2). Kabarcıklar kaçının. Silikon diş sakız ile kapak kenarları mühür. Sakız katılanına kadar bekleyin. Burada duraklatmak ve 4 °C’de bir gecede slayt saklayabilirsiniz.NOT: Diğer smFISH protokolleri oksijen atma reaktifleri eklemeyi (örneğin, glikoz oksidaz/katalaz) veya floroforların fotostabilitesini artırmak için ticari bir anti-fade montaj ortamı14,26 kullanarak öneririz. 8. Görüntüleme İlgi çekici bir alan bulmak için faz kontrast görüntülemesinin canlı modunu kullanın. Sahne joystick manevra tarafından bir kuyu içinde görüş alanını değiştirin. Hücre yoğunluğunun en uygun olduğu alanı seçin (örneğin, çoğunlukla ayrılmış birçok hücre vardır). Faz kontrastlı hücre görüntüleri odakta olacak şekilde z-odaklama ayarlayın. Cy5 (4-s pozlama), Cy3 (2-s pozlama) ve faz kontrastı (0,2’s pozlama) sırasına göre anlık görüntüler alın.NOT: Cy3B boya molekülleri Cy3 kanalında ve görüntülercy3 görüntüleri olarak adlandırılır. Bir kuyu içinde ~10 farklı alanların görüntülerini elde etmek için Adımları 8.1-8.2’yi yineleyin. Hedefi başka bir kuyuya taşıyın ve Steps 8.1-8.3’u tekrarlayın. Görüntüleri TIFF dosyaları olarak dışa aktarın. (İsteğe bağlı) Görüntü kayıt amacıyla Cy5 ve Cy3 kanalları arasındaki mekansal kaymayı belirlemek için Cy5 ve Cy3 kanallarında kapak yüzeyinde adsorbe edilen görüntü çok renkli boncuklar. Temiz bir kapak yüzeyi üzerinde ~10 μL çok renkli floresan boncuk (0,2 μm çapında) uygulayın ve 10-30 dakika bekleyin. ~50 μL PBS ile yıkandıktan sonra ~ 5 μL PBS uygulayın ve kapağı cam bir kaydırakla sandviç uygulayın. Mikroskobu kapatın ve monte edin. Hem Cy5 hem de Cy3 kanallarında görüntü boncukları. 9. Görüntü analizi NOT: Bu adımda kullanılan Matlab kodu aşağıdaki GitHub web sitesinde mevcuttur: https://github.com/sjkimlab/Code_Publication/tree/master/JoVE_2020. GitHub klasörü, hücre segmentasyonu ve nokta tanımlama için parametre değerleri de dahil olmak üzere görüntü çözümlemesi için gereken her şeyi içerir. Bu adımdaki yordam, “FISHworkflow.m” adlı ana komut dosyasında daha da açıklanmıştır. MicrobeTracker27 veya Oufti28gibi bir hücre segmentasyon aracını açın ve faz kontrast görüntülerini yükleyin. “Bağımsız çerçeveler” seçeneğini belirleyin ve hücrelerin tanımlandığı ve konturlarıhesaplanan segmentasyon işlemini başlatmak için “Tüm çerçeveler” adlı düğmeye basın(Şekil 3B,C).NOT: Bu yazılım paketlerini kullanmak için ayrıntılı protokoller çevrimiçi olarak mevcuttur (örneğin, oufti.org). MicrobeTracker veya Oufti spotFinder fonksiyonu nda Cy5 floresan görüntüleri yükleyin ve 2D Gaussian montaj dayalı nokta tanımlama ve nicelik başlamak için “Çalıştır” düğmesine basın (Şekil 3B,C). Cy3 kanalındaki noktaları analiz etmek için Cy3 floresan görüntüleri için bu adımı tekrarlayın. Bu adım, yoğunlukları ve koordinatları da dahil olmak üzere her hücredeki noktalar bir listesini üretir. (İsteğe bağlı) FISHworkflow.m dosyasında açıklandığı gibi, bir eşik kullanarak loş noktaları (yanlış pozitifler) filtreleyin.NOT: Negatif kontroldeki floresan noktaları inceleyin (örneğin MG1655 ΔlacZ)ve yanlış pozitifleri filtrelemek için eşiği belirleyin. Tek bir mRNA’nın nokta yoğunluğunu elde etmek için, sıfır zamanda ölçülen nokta yoğunluklarının bir listesini kullanın (IPTG eklemeden önce) ve iki karışım bileşenine sahip Bir Gauss karışım modeliyle nokta yoğunluklarının dağılımına uyun. Tek bir mRNA’nın nokta yoğunluğu olarak ilk Gauss popülasyonunun (Şekil 3D,E’dekisiyah çizgi) en yüksek konumunu alın. Tek bir 5′ ve 3’lacZ mRNA nokta yoğunluğu elde etmek lacZ için ayrı ayrı Cy5 noktalar ve Cy3 noktalar için bunu gerçekleştirin.NOT: Tek bir mRNA’nın nokta yoğunluğu farklı deneylerde biraz değişebildiği için bunu her zaman denemesinde tekrarlayın. Bir noktanın floresan yoğunluğunu tek bir mRNA’nın yoğunluğuyla (Adım 9.4’ten) bölüp bir nokta içindeki mRNA sayısını elde edin. Bir hücredeki toplam mRNA sayısını hesaplamak için bir hücre içindeki normalleştirilmiş nokta yoğunluklarını toplamı(Şekil 3F). Bu hesaplamaları 5′ ve 3′ mRNA için ayrı ayrı gerçekleştirin. Her zaman noktasında (şekil 4B)hücre başına ortalama mRNA sayılarını hesaplayın ve çizin ve transkripsiyon ve mRNA bozulmasının ortalama mRNA düzeylerindeki zamansal değişimden in vivo kinetiklerini analiz edin(Şekil 4B). Transkripsiyon uzama oranını elde etmek için, 5′ ve 3′ mRNA sinyallerindeki ilk artışa bir çizginin en az kareler uydurmasını gerçekleştirin ve bazal seviyelere kesitleri belirleyin(Şekil 4B). Bu kesişmeler arasındaki fark, RNAP’ların 5′ sonda bölgesinden 3′ sonda bölgesine ortalama süreyi gösterir. Transkripsiyon uzama sının ortalama oranını elde etmek için bu süreyle iki sonda kümesi (2 kb) arasındaki mesafeyi bölün. mRNA bozunma oranını elde etmek için, üstel bozunma fonksiyonu olan y = A·exp(-t/τ) 5′ ve 3′ mRNA sinyallerinin son bozunma bölgesine (örneğin, Şekil 4B)sığdırın. Montaj parametresi, τ, ortalama mRNA ömrüdür. (İsteğe bağlı) Gen ekspresyonundaki hücreden hücreye değişimi (örneğin, Şekil 4C’degösterilen indüksiyona hücre düzeyinde yanıt), her hücredeki mRNA numaralarının dağılımına göre analiz edin (Adım 9.5’te hesaplanır). (İsteğe bağlı) Bir hücrenin ana ve küçük eksenleri boyunca nokta konumu hakkında bilgi kullanarak (Adım 9.2’den elde edilen), mRNA’ların lokalizasyonunu analiz edin (Şekil 4D,E). (İsteğe bağlı) Cy5 ve Cy3 kanallarında saptanan noktaların lokalizasyonunu karşılaştırarak 5′ ve 3’ mRNA’ların(Şekil 5)ortak lokalizasyonunu analiz edin. MicrobeTracker spotFinderF fonksiyonu çok renkli boncuk (Adım 8.6) görüntüleri yük ve Cy5 ve Cy3 kanallarında boncuk centroids koordinatlarını elde. Cy5 ve Cy3 kanallarının birbirine göre nasıl kaydırıldığı ve döndürüldüğünü bildiren affine dönüşüm matrisini hesaplamak için merkezoid koordinatlar listesini kullanın29. Cy5 koordinatındaki Cy3 görüntülerini dönüştürmek için cy5 ve Cy3 FISH görüntülerine affine dönüştürme matrisini uygulayın. Bir nokta farklı bir kanaldaki başka bir noktayla birlikte yerelleştirilmişse sınıflandırın. Örneğin, merkezsoidleri arasındaki mesafe 150 nm’den azsa Cy5 kanalındaki bir noktanın Cy3 kanalındaki başka bir noktayla birlikte lokalize olduğu kabul edilir(Şekil 5). Her zaman noktasında Cy3 noktaları ile “eş lokalize” olarak sınıflandırılan kaç Cy5 noktalarını analiz edin. Ayrıca, eş lokalize noktaların yoğunluğunu analiz edin (Şekil 5).