Этот протокол описывает применение одномекулярной флуоресценции на месте гибридизации (smFISH) для измерения кинетики in vivo синтеза и деградации мРНК.
Одномекулярная флуоресценция на месте гибридизации (smFISH) позволяет подсчитать абсолютное количество мРНК в отдельных клетках. Здесь мы описываем применение smFISH для измерения темпов транскрипции и деградации мРНК в кишечной палочке. Поскольку smFISH основан на фиксированных клетках, мы выполняем smFISH в нескольких точках времени во время эксперимента, т.е. когда клетки претерпевают синхронизированные изменения после индукции или подавления экспрессии генов. В каждой точке времени субрегионы мРНК спектрально отличаются от удлинением транскрипции зонда и преждевременным прекращением. Результат этого протокола также позволяет анализировать внутриклеточную локализацию мРНК и неоднородность в числах копирования мРНК среди клеток. Используя этот протокол, многие образцы (50 евро) могут быть обработаны в течение 8 ч, как и количество времени, необходимое для нескольких образцов. Мы обсуждаем, как применить этот протокол для изучения транскрипции и деградации кинетики различных мРНК в бактериальных клетках.
Поток генетической информации из ДНК в мРНК и белок является одним из самых фундаментальных клеточных процессов, регуляции которого важны для клеточнойпригодности 1. Количество мРНК в клетке определяется двумя динамическими процессами, транскрипцией и деградацией мРНК. Однако, как транскрипция и деградация мРНК регулируются во времени и пространстве одной клетки остается не полностью понятым, в основном из-за нехватки экспериментальных методов количественного измерения их кинетики in vivo.
Методы, основанные на общей мРНК, извлеченные из популяции клеток, таких как Северная помарка, RT-PCR, секвенирование РНК и микроармей экспрессии генов, могут измерять относительную разницу в уровнях мРНК и широко использовались для анализаскорости удлинивания транскрипции 2,,3,,4,,5 или скоростидеградации мРНК 6,,7. Тем не менее, они не обеспечивают абсолютное количество мРНК на ячейку, и, следовательно, они не подходят для зондирования скорости инициациитранскрипции 8. Кроме того, поскольку мРНК извлекаются из популяции клеток, пространственное распределение мРНК в пределах одной клетки и изменчивость числа копий мРНК среди клеток не могут быть измерены.
Секвенирование РНК нового поколения на отдельных клетках (scRNAseq) может количественно определить количество мРНК на клетку в геномной шкале9. Тем не менее, по-прежнему трудно использовать этот метод для измерения транскрипции кинетики, из-за проблем с подготовкой образца и высокой стоимости. В частности, применение scRNAseq к бактериям было технически затруднено из-за низкого изобилиямРНК 10,,11.
Одномекулярная флуоресценция на месте гибридизации (smFISH) основана на гибридизации флуоресцентно помеченных однострухихзондов,последовательности которых дополняют целевуюмРНК интереса 12,13. Концепция гибридизации конкретных последовательностей аналогична концепции, используемой в Северной помарке или РТ-ПЦР, но гибридизация происходит на месте в пределах фиксированных ячеек, чтобы сохранить местную локализацию мРНК. Сигнал одной мРНК усиливается с помощью многих зондов, 20 нуклеотидов (nt) в длину, гибридизируясь с различными частямимРНК (рисунок 1A)13. В этом “плитка” зонд подход, количество зондов, необходимых для обнаружения одной мРНК устанавливает более низкий предел по длине мРНК, которые могут быть проверены. Кроме того, мРНК интерес может быть транскрипционно сливается с некодирующих массив тандем Лак оператора последовательностей, таким образом, что несколько копий флуоресцентно помечены лако зонд гибридизироваться на однумРНК ( Рисунок 1B)14.
smFISH был использован для количественной оценки количества мРНК на клетку в стабильном состоянии (т.е. при синтезе и распаде находятся в балансе) и для анализа среднего и изменчивости мРНК средибактериальных клеток 15,,16,17. В последнее время smFISH был применен для количественной оценки мРНК номера в неустойком состоянии, сразу после индукции или подавления экспрессии генов в кишечнойпалочке 18,19,20. Временные изменения в абсолютных числах копий мРНК затем использовались для расчета скорости инициации транскрипции, удлинения и прекращения, а также скорости деградации мРНК. Для этого приложения обычные процедуры smFISH могут быть громоздкими, поскольку существует множество образцов, каждый из которых представляет одну точку времени, которые должны пройти через несколько шагов буферного обмена (т.е. центрифугации и стирки). Здесь мы описываем протокол smFISH, в котором шаги обработки образца резко упрощаются, прилипая к поверхности крышки и аспирируя жидкости с вакуумной системойфильтрации 14,19. В качестве примера можно привести экспрессию лака в кишечной палочке,демонстрируется полный рабочий процесс (рисунок 2),включаяанализ изображений (рисунок 3),что дает виво кинетику транскрипции (начало, удлинение и прекращение) и деградацию мРНК, изменчивость клеток к клетке в выражении мРНК и локализацию мРНК. Мы ожидаем, что протокол широко применим к зондированию кинетики vivo и локализации других мРНК у различных видов бактерий.
Здесь мы представили протокол smFISH для измерения кинетики мРНК в кишечной палочке. В ранее опубликованных протоколах smFISH длябактерий 23, клетки хранились в трубках до самого конца протокола, то есть до тех пор, пока они не будут готовы к визуализации. Хотя он имеет много преимуществ, таких как минимальная неспецифическая привязка флуоресцентныхзондов на поверхности крышки 23, трудно следовать этим протоколам, когда Есть много образцов из эксперимента тайм-курса. Во-первых, необходимо отведать и даже собрать достаточно большой объем клеток (1 мл) до фиксации. Во-вторых, образцы клеток необходимо центрифугировать несколько раз для обмена растворами и мытья после шага гибридизации. В нашем протоколе небольшой объем (lt;1 mL) культуры непосредственно смешивается с фиксироваваемым раствором в трубке объемом 1,5 мл, помогая быстро «заморозить» состояние клетки в момент отбора проб. Кроме того, клетки остаются прикрепленными к поверхности на протяжении всей процедуры, и различные решения могут быть быстро обменяются, аспирируя жидкости с вакуумной системой фильтрации и применяя раствор капли сразу с многоканальной пипеткой. Эта разница делает наш протокол очень выгодным, когда большое количество образцов необходимо обрабатывать сразу. Используя наш протокол, 12-48 образцов могут быть обработаны одновременно, и вся процедура FISH может быть завершена в течение 8 часов, примерно аналогичное количество времени, необходимое для нескольких образцов(рисунок 2). Несмотря на то, что в качестве примера мы использовали экспрессию лака в кишечной палочке, протокол широко применим к различным генам и бактериальным видам с соображениями, обсуждаемыми ниже.
Для различных генов, первое, что нужно рассмотреть это smFISH зондов. Можно разработать олигонуклеотидные зонды, которые плитки мРНК интереса (Рисунок 1A)13. В этом “плитка” зонд подход, каждый зонд является 20 базы длиной и помечены флюорофор на 5′ или 3′ терминуса. Эта стратегия удобна тем, что генетические манипуляции не нужны. Кроме того, тандемное повторение последовательности 20 bp, чужое геномной последовательности (например, массив последовательности лако в Caulobacter crescentus14), может быть вставлено в непереведенную область гена, представляющий интерес, и один зонд, дополняющий повторную единицу, используется для обозначения мРНК («array» подход; Рисунок 1B). В обоих случаях множественные флюорофоры украшают мРНК, давая усиленный сигнал флуоресценции, который можно легко отличить от одного зонда, не особенно связанного внутри клетки.
Выбирать ли подходы «плитка» или «array» зависит от отрицательного контроля, образца, в котором проверяется неспецифическая привязка зондов, поскольку в ней отсутствует целевая мРНК. Для плиточныезонды ( Рисунок 1A), мутант штамм без гена интереса или состояние, при котором ген не транскрибируется (например, репрессии лака) может служить отрицательным контролем для тестирования неспецифической привязки зондов. Для массива на основе smFISH (Рисунок 1B), дикий тип штамма не хватает массива может служить в качестве отрицательного контроля, поскольку он не содержит связывающих сайтов для зондов.
Оптимальные условия гибридизации могут зависеть от последовательности зонда и даже выбора красителей флюорофора. Мы оптимизировали условие гибридизации для наборов зондов лака, сохраняя температуру гибридизации на уровне 37 градусов по Цельсию и тестируя различные концентрации наборов зондов и формамида в растворе гибридизации. Более высокие концентрации формамида, как правило, снижают как неспецифические, так и специфическиесвязывающие 26,,35. Мы рекомендуем систематически менять гибридизацию и условия ее стирки, сохраняя при этом время гибридизации и температуру на прежнем уровне. По мере того как условие становится более строгим, как неспецифическое, так и специфическое связывающее снижение(рисунок 6). Важно найти точку, когда неспецифическая привязка начинает бить ниже приемлемого порога без дальнейшего ущерба для конкретной привязки. Например, мы использовали уровень сигнала, полученный без каких-либо зондов (“без зондов”) в качестве порога(рисунок 6).
Двухцветный метод smFISH, маркующий две отдельные области мРНК, ограничивается длинными генами. Для измерения скорости удлинения транскрипции мы воспользовались тем фактом, что лакс длинный (3075 б.п.) и его выражение может быть вызвано IPTG. Когда ген короткий, трудно спроектировать два набора плиточные зонды (около 5′ и 3′ концов) и решить задержку времени между появлениями 5′ против 3′ mRNA регионов. В этом случае можно рассчитывать зарождающиеся мРНК в стабильном состоянии с помощью smFISH и анализировать их распределение с помощью аналитической модели, которая имеет скорость удлинение транскрипции в качествеподходящего параметра 20. Кроме того, когда ген, представляющий интерес, не является неодохвимым, можно лечить клетки с рифампицином в нулевое время и измерять временное изменение в 5′ и 3′ мРНК субрегионные. Задержка от уменьшения сигнала 5′ mRNA до сигнала 3′ mRNA может быть использована для расчета скорости удлинение транскрипции, как это было сделаноранее 31.
Наконец, протокол smFISH является универсальным и может сочетаться с другими схемами маркировки. Ранее локус ДНК визуализировали вместе с мРНК путем объединения мРНК ФИШ либо с ДНК FISH14, либо с флуоресцентной системой репортера-оператора20. Белковые продукты можно визуализировать, выполняя иммунофлуоресценцию вместе с мРНКFISH 14,,36. Кроме того, его можно комбинировать с трехмерноймикроскопией супер-разрешения 37 для визуализации мРНК во всехтрех измерениях 38,,39.
The authors have nothing to disclose.
Этот протокол был разработан С.К. во время ее постдокторских исследований в лаборатории доктора Кристин Джейкобс-Вагнер в Медицинском институте Говарда Хьюза и Институте микробных наук при йельском университете. Мы благодарим доктора Джейкобс-Вагнер и ее сотрудников лаборатории за различные вклады в разработку метода и Лору Тройер за критическое прочтение рукописи. С.К. признает поддержку программы ученых Сирла; К.В. признает поддержку Джеймса Стипендиата Preble Research Award от Университета Иллинойса.
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |