Dieses Protokoll beschreibt eine Anwendung der einmolekularen Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH), um die In-vivo-Kinetik der mRNA-Synthese und -Degradation zu messen.
Die Single-Molekül-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH) ermöglicht die Zählung der absoluten Anzahl von mRNAs in einzelnen Zellen. Hier beschreiben wir eine Anwendung von smFISH zur Messung der Transkriptionsraten und mRNA-Abbauraten bei Escherichia coli. Da smFISH auf festen Zellen basiert, führen wir smFISH zu mehreren Zeitpunkten während eines Zeitverlaufsexperiments durch, d.h. wenn Zellen bei Induktion oder Unterdrückung der Genexpression synchronisierte Veränderungen durchlaufen. Zu jedem Zeitpunkt werden Subregionen einer mRNA spektral unterschieden, um Transkriptionsdehnung und vorzeitige Beendigung zu sonden. Das Ergebnis dieses Protokolls ermöglicht auch die Analyse der intrazellulären Lokalisierung von mRNAs und Heterogenität in mRNA-Kopierzahlen zwischen Zellen. Mit diesem Protokoll können viele Samples (50)) innerhalb von 8 h verarbeitet werden, wie die Zeit, die für nur wenige Proben benötigt wird. Wir besprechen, wie dieses Protokoll angewendet werden kann, um die Transkriptions- und Abbaukinetik verschiedener mRNAs in Bakterienzellen zu untersuchen.
Der Fluss genetischer Informationen von DNA zu mRNA und Protein ist einer der grundlegendsten zellulären Prozesse, dessen Regulierung für die zelluläre Fitness wichtig ist1. Die Anzahl der mRNAs in einer Zelle wird durch zwei dynamische Prozesse bestimmt, Transkription und mRNA-Abbau. Wie Transkription und mRNA-Abbau in Zeit und Raum einer einzelnen Zelle reguliert werden, bleibt jedoch nicht vollständig verstanden, was vor allem auf den Mangel an experimentellen Methoden zur quantitativen Messung ihrer Kinetik in vivo zurückzuführen ist.
Methoden, die auf der Gesamtanzahl der mRNAs basieren, die aus einer Population von Zellen extrahiert wurden, wie Northern Blot, RT-PCR, RNA-Sequenzierung und Genexpressionsmikroarrays, können den relativen Unterschied in mRNA-Spiegeln messen und wurden weit verbreitet, um die Rate der Transkriptionsdehnung2,3,4,5 oder die Rate des mRNA-Abbaus6,7zu analysieren. Sie liefern jedoch nicht die absolute Anzahl von mRNAs pro Zelle, und daher sind sie nicht geeignet, die Rate der Transkriptionsinitiierung zu untersuchen8. Da mRNAs aus einer Zellgesamtheit extrahiert werden, können die räumliche Verteilung von mRNAs innerhalb einer einzelnen Zelle und die Variabilität der mRNA-Kopierzahlen zwischen den Zellen nicht gemessen werden.
Die RNA-Sequenzierung der nächsten Generation an einzelnen Zellen (scRNAseq) kann die Anzahl der mRNAs pro Zelle in einer genomischen Skala9quantifizieren. Aufgrund von Herausforderungen bei der Probenvorbereitung und hohen Kosten bleibt es jedoch schwierig, diese Technik zur Messung der Transkriptionskinetik zu verwenden. Insbesondere die Anwendung von scRNAseq auf Bakterien war aufgrund der geringen mRNA-Überfluss10,11technisch schwierig.
Die Einmolekülfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (smFISH) basiert auf der Hybridisierung fluoreszierend markierter einsträngiger Sonden, deren Sequenzen die Ziel-mRNA von Interesse12,13komplementär machen. Das Konzept der sequenzspezifischen Hybridisierung ähnelt dem, das in Northern Blot oder RT-PCR verwendet wird, aber die Hybridisierung erfolgt in situ innerhalb fester Zellen, um die native Lokalisierung von mRNAs zu erhalten. Das Signal einer einzelnen mRNA wird mit vielen Sonden verstärkt, die 20 Nukleotide (nt) in der Länge sind und mit verschiedenen Teilen einer mRNA hybridisieren (Abbildung 1A)13. Bei diesem “Kachel”-Sondenansatz legt die Anzahl der Sonden, die zum Nachweis einer einzelnen mRNA erforderlich sind, eine niedrigere Grenze für die Länge der mRNA fest, die untersucht werden kann. Alternativ kann die mRNA von Interesse transkriptionsweise zu einem nicht-kodierenden Array von Tandem-Lac-Operatorsequenzen verschmolzen werden, so dass mehrere Kopien einer fluoreszierend markierten LacO-Sonde zu einer einzigen mRNA hybridisieren (Abbildung 1B)14.
smFISH wurde verwendet, um die Anzahl der mRNAs pro Zelle im stationären Zustand zu quantifizieren (d. h. wenn Synthese und Zerfall im Gleichgewicht sind) und um den Mittelwert und die Variabilität von mRNAs zwischen Bakterienzellen15,16,17zu analysieren. Kürzlich wurde smFISH angewendet, um mRNA-Zahlen im nicht-stabilen Zustand zu quantifizieren, direkt nach der Induktion oder Unterdrückung der Genexpression in E. coli18,19,20. Die zeitlichen Veränderungen der absoluten mRNA-Kopierzahlen wurden dann verwendet, um die Rate der Transkriptionsinitiierung, Dehnung und Beendigung sowie die Rate des mRNA-Abbaus zu berechnen. Für diese Anwendung können herkömmliche smFISH-Verfahren umständlich sein, da es viele Proben gibt, die jeweils einen Zeitpunkt darstellen und mehrere Pufferaustauschschritte durchlaufen müssen (z. B. Zentrifugation und Waschen). Hier beschreiben wir ein smFISH-Protokoll, bei dem die Probenhandhabungsschritte drastisch vereinfacht werden, indem Zellen an der Oberfläche eines Deckellipss haften und Flüssigkeiten mit einem Vakuumfiltrationssystem14,19anhaften. Am Beispiel der Expression von lacZ in E. coli wird der vollständige Arbeitsablauf (Abbildung 2) demonstriert, einschließlich der Bildanalyse ( Abbildung3), die die In-vivo-Kinetik der Transkription (Initiierung, Dehnung und Beendigung) und den mRNA-Abbau, die Zell-zu-Zell-Variabilität in der mRNA-Expression und die mRNA-Lokalisierung ergibt. Wir gehen davon aus, dass das Protokoll weithin auf die In-vivo-Kinetik und Lokalisierung anderer mRNAs in verschiedenen Bakterienarten anwendbar ist.
Hier haben wir ein smFISH-Protokoll zur Messung der mRNA-Kinetik in E. coli vorgestellt. In den zuvor veröffentlichten smFISH-Protokollen für Bakterien23wurden Zellen bis zum Ende des Protokolls in den Röhren aufbewahrt, d.h. bis sie zur Bildgebung bereit sind. Obwohl es viele Vorteile hat, wie z. B. minimale unspezifische Bindung von Fluoreszenzsonden auf der Deckgeradenoberfläche23, ist es schwierig, diese Protokolle zu befolgen, wenn es viele Proben aus einem Zeitverlaufsexperiment gibt. Zunächst muss ein relativ großes Volumen von Zellen (>1 ml) vor der Fixierung beprobt und sogar geerntet werden. Zweitens müssen die Zellproben mehrmals zentrifugiert werden, um Lösungen auszutauschen und nach dem Hybridisierungsschritt zu waschen. In unserem Protokoll wird ein kleines Volumen (<1 ml) Kultur direkt mit einer Befestigungslösung in einem 1,5-ml-Rohr vermischt, was hilft, den Zellzustand zum Zeitpunkt der Probenahme schnell einzufrieren. Außerdem bleiben die Zellen während des gesamten Verfahrens an der Oberfläche befestigt, und verschiedene Lösungen können schnell ausgetauscht werden, indem Flüssigkeiten mit einem Vakuumfiltrationssystem angesaugt und Lösungstropfen gleichzeitig mit einer Mehrkanalpipette aufgebracht werden. Dieser Unterschied macht unser Protokoll sehr vorteilhaft, wenn eine große Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeitet werden muss. Mit unserem Protokoll können 12-48 Proben gleichzeitig behandelt werden und die gesamte FISH-Prozedur kann innerhalb von 8 Stunden abgeschlossen werden, etwa eine ähnliche Zeit, die für ein paar Proben benötigt wird (Abbildung 2). Obwohl wir die Expression von lacZ in E. coli als Beispiel verwendet haben, ist das Protokoll weithin auf verschiedene Gene und Bakterienarten mit überlegungen anwendbar, die unten erläutert werden.
Bei verschiedenen Genen sind als erstes smFISH-Sonden zu beachten. Man kann Oligonukleotid-Sonden entwerfen, die die mRNA von Interesse fliesen (Abbildung 1A)13. Bei diesem “Fliesen”-Sondenansatz ist jede Sonde 20 Basislang und mit einem Fluorophor an der Endstation 5′ oder 3′ beschriftet. Diese Strategie ist praktisch, da keine genetische Manipulation erforderlich ist. Alternativ kann eine Tandem-Wiederholung von 20 bp Sequenz, fremd zur genomischen Sequenz (z. B. eine Reihe von LacO-Sequenzen in Caulobacter crescentus14), in den unübersetzten Bereich eines Gens von Interesse eingefügt werden und eine einzelne Sonde, die zur Wiederholungseinheit ergänzt, wird verwendet, um die mRNA zu kennzeichnen (“Array”-Ansatz; Abbildung 1B). In beiden Fällen schmücken mehrere Fluorophore eine mRNA und geben ein verstärktes Fluoreszenzsignal, das leicht von einer einzelnen Sonde unterschieden werden kann, die nicht spezifisch in einer Zelle gebunden ist.
Ob “Kachel”- oder “Array”-Ansätze gewählt werden sollen, hängt von der negativen Kontrolle ab, einer Probe, bei der die unspezifische Bindung von Sonden getestet wird, weil ihr die Ziel-mRNA fehlt. Bei Fliesensonden (Abbildung 1A) kann ein mutierter Stamm ohne das Gen von Interesse oder eine Bedingung, bei der das Gen nicht transkribiert wird (z. B. Unterdrückung von lacZ), als Negativkontrolle für die Prüfung der unspezifischen Bindung von Sonden dienen. Für den Array-basierten smFISH (Abbildung 1B) kann ein Wildtypstamm, der das Array fehlt, als Negativkontrolle dienen, da er keine Bindungsstellen für die Prüfpunkte enthält.
Optimale Hybridisierungsbedingungen können von den Sondensequenzen und sogar von der Wahl der Fluorophorfarbstoffe abhängen. Wir haben die Hybridisierungsbedingung für lacZ-Sondensätze optimiert, indem wir die Hybridisierungstemperatur bei 37 °C gehalten und verschiedene Konzentrationen von Sondensätzen und Formamid in der Hybridisierungslösung getestet haben. lacZ Höhere Konzentrationen von Formamid neigen dazu, sowohl unspezifische als auch spezifische Bindung zu reduzieren26,35. Wir empfehlen, die Hybridisierung und ihre Waschbedingungen systematisch zu ändern und gleichzeitig die Hybridisierungszeit und -temperatur gleich zu halten. Wenn die Bedingung strenger wird, nehmen sowohl unspezifische als auch spezifische Bindungsbindungen ab (Abbildung 6). Es ist wichtig, einen Punkt zu finden, an dem die unspezifische Bindung beginnt, unter einen akzeptablen Schwellenwert zu fallen, ohne dass eine spezifische Bindung weiter beeinträchtigt wird. Beispielsweise haben wir den signalpegel, der ohne Sonden (“keine Sonden”) erhalten wurde, als Schwellenwert verwendet (Abbildung 6).
Die zweifarbige smFISH-Methode, die zwei separate Bereiche einer mRNA kennzeichnet, ist auf lange Gene beschränkt. Um die Rate der Transkriptionsdehnung zu messen, haben wir die Tatsache genutzt, dass lacZ lang ist (3075 bp) und seine Expression durch IPTG induziert werden kann. Wenn ein Gen kurz ist, ist es schwierig, zwei Fliesen-Sondensätze (nahe 5′ und 3′ Enden) zu entwerfen und die Zeitverzögerung zwischen den Auftritten von 5′ vs. 3′ mRNA-Regionen aufzulösen. In diesem Fall kann man im stetigen Zustand von smFISH aufkeimende mRNAs zählen und deren Verteilung mit einem analytischen Modell analysieren, das die Rate der Transkriptionsdehnung als passenden Parameter20hat. Wenn ein Gen von Interesse nicht induzierbar ist, kann man auch Zellen mit Rifampicin zum Zeitpunkt Null behandeln und die zeitliche Veränderung in 5′ und 3′ mRNA Subregionen messen. Die Verzögerung von der Abnahme des 5′ mRNA-Signals auf das 3′ mRNA-Signal kann dann verwendet werden, um die Rate der Transkriptionsdehnung zu berechnen, wie zuvor31getan.
Schließlich ist das smFISH-Protokoll vielseitig und kann mit anderen Kennzeichnungsschemata kombiniert werden. Zuvor wurde DNA-Lokus zusammen mit mRNAs durch die Kombination von mRNA FISH mit DNA FISH14 oder fluoreszierendem Reporter-Operator-System20visualisiert. Proteinprodukte können durch Immunfluoreszenz zusammen mit mRNA FISH14,36visualisiert werden. Es kann auch mit dreidimensionaler superhochauflösender Mikroskopie37 kombiniert werden, um mRNAs in allen drei Dimensionen38,39zu visualisieren.
The authors have nothing to disclose.
Dieses Protokoll wurde von S.K. während ihrer Postdoktorandenforschung im Labor von Dr. Christine Jacobs-Wagner am Howard Hughes Medical Institute und am Microbial Sciences Institute der Yale University entwickelt. Wir danken Dr. Jacobs-Wagner und ihren Labormitgliedern für die verschiedenen Beiträge während der Methodenentwicklung und Laura Troyer für die kritische Lektüre des Manuskripts. S.K. erkennt die Unterstützung des Searle Scholars Program an; K.V. würdigt die Unterstützung des James Scholar Preble Research Award der University of Illinois.
Bacterial strain | |||
Escherichia coli MG1655 | |||
Chemicals, peptides, and others | |||
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34851 | UPLC buffer B |
Ammonium chloride | Fisher Chemical | A661-500 | To make M9 medium |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B2518 | Probe hybridization |
Calcium chloride | Acros Organics | 349610250 | To make M9 medium |
Casamino acid | BD Difco | 223050 | To make M9 medium |
Cy3B NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA63101 | Fluorophore for FISH probes |
Cy5 NHS ester | GE Healthcare Life Sciences | PA15101 | Fluorophore for FISH probes |
DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
Dextran sulfate | Millipore | S4030 | Probe hybridization |
Dextrose | Fisher Chemical | D16 | To repress the expression of lacZ |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | To dissolve fluorophores |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | Probe hybridization |
Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | Used in DNA purification, lysis, and cleaning coverslips |
FISH probes | Biosearch Technologies | Sequences are published in ref#16 | |
Formaldehyde | Ladd Research Industries | 20295 | Fixation |
Formamide | American Bio | AB00600 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
Glycerol | Americanbio | AB00751-01000 | To make M9 medium |
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) | Invitrogen | 15529019 | lacZ induction |
Magnesium sulfate | Fisher Chemical | M65-500 | To make M9 medium |
2-Nitrophenyl β-D-fucopyranoside (ONPF) | Santa Cruz Biotechnology | sc-216258 | lacZ repression |
Picodent twinsil 22 | Picodent | 1300 1000 | Sealant |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | To treat the coverslip surface |
Potassium chloride | Fisher BioReagents | BP366-500 | To make PBS |
Potassium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP362-500 | To make PBS and M9 medium |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | To stop transcription initiation |
Saline-sodium citrate buffer (SSC) | Invitrogen | AM9763 | Probe hybridization, pre-hybridization, and wash |
sodium bicarbonate | Fisher BioReagents | BP328-500 | Fluorophore-probe conjugation |
Sodium chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For DNA purification, PBS and M9 medium |
Sodium phosphate dibasic | Fisher BioReagents | BP332-500 | To make PBS and M9 medium |
Sodium phosphate monobasic | Fisher BioReagents | BP329-500 | To make a sodium phosphate buffer |
Super PAP Pen | Invitrogen | 8899 | Hydrophobic marker for coverslips |
TetraSpek microspheres | Invitrogen | T7280 | Controls for multi-channel registration |
Thiamine | Sigma-Aldrich | T1270 | To make M9 medium |
Triethylammonium acetate | Sigma-Aldrich | 90358 | UPLC buffer A |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | 94742 | Probe hybridization and pre-hybridization |
Equipment | |||
C18 column | Waters | Acquity BEH C18 column | |
Countertop centrifuge | Eppendorf | 5425 | |
Countertop incubator | Eppendorf | Thermomixer F1.5 | |
Incubator (Oven) | Thermo Scientific | 51030514 | Gravity convection |
Water purification system | Millipore | Milli-Q Reference | |
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | |
Nitrogen gas | Building | For blow-drying coverslips and glass slides | |
UPLC | Waters | Acquity UPLC system | |
Vacuum and aspirator | Building | Aspirator is made of a filtration flask with a side arm. | |
Vacuum concentrator | Labconco | 7810010 | Centrivap; to dry samples collected from UPLC. |
Vortexer | Scientific Industries | Genie-2 SI-0236 | |
Water bath shaker | New Brunswick | Innova 3100 | Critical for time-course experiments |
Water bath sonicator | VWR | 97043-960 | To clean coverslips and glass slides |
Tools | |||
1.5-mL tubes | Eppendorf | 22431021 | DNA lobind tubes |
1000-uL pipette tip box | Denville Scientific | P1126 | An empty box after using all the tips |
Coplin jar | SPI | 01240-AB | To clean coverslips and glass slides |
Coverslip | Fisher Scientific | 22-050-230 | 24×60 No1 |
Filtered pipette tips | Denville Scientific | P1121,P1122,P1126 | SHARP® Precision Barrier Tips |
Forceps | SPI | K35a | To handle clean coverslips and glass slides |
Glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
Gloves | Microflex | MK-296-M | |
Multichannel pipetter | Eppendorf | 2231300045 | To use in the washing step (#7) |
Pipette | Gilson | P1000, P200, P20 | |
Reagent reservoir | MTC Bio | P8025-1S | To use in the washing step (#7) |
Syringe filter (0.22 um) | Millipore | SLGS033SS | |
Timer | VWR | 62344-641 | |
Software and algorithms | |||
MATLAB | Mathworks | R2013 and up | https://www.mathworks.com |
MicrobeTracker or Oufti | https://www.github.com/JacobsWagnerLab/MicrobeTracker | ||
https://oufti.org/ | |||
Stellaris Probe Designer | Biosearch Technologies | https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer | |
Microscope | |||
CCD camera | Hamamatsu Photonics | Orca-II-ER | |
Cy3 filter set | Chroma | 49004 | |
Cy5 filter set | Chroma | 49006 | |
Epi-fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti | For phase-contrast and epi fluorescence |
Fluorescence excitation source | Lumencor | SOLA-E | |
Nikon Elements software | Nikon | software that controls the microscope setup | |
Phase-contrast 100x objective | Nikon | Plan Apochromat (NA 1.45) | |
Probe sequence | |||
DNA oligos with C6 amino modification at the 5' end | Biosearch Technologies Inc | ||
lacZ1 | GTGAATCCGTAATCATGGTC | 5' mRNA | |
lacZ2 | TCACGACGTTGTAAAACGAC | 5' mRNA | |
lacZ3 | ATTAAGTTGGGTAACGCCAG | 5' mRNA | |
lacZ4 | TATTACGCCAGCTGGCGAAA | 5' mRNA | |
lacZ5 | ATTCAGGCTGCGCAACTGTT | 5' mRNA | |
lacZ6 | AAACCAGGCAAAGCGCCATT | 5' mRNA | |
lacZ7 | AGTATCGGCCTCAGGAAGAT | 5' mRNA | |
lacZ8 | AACCGTGCATCTGCCAGTTT | 5' mRNA | |
lacZ9 | TAGGTCACGTTGGTGTAGAT | 5' mRNA | |
lacZ10 | AATGTGAGCGAGTAACAACC | 5' mRNA | |
lacZ11 | GTAGCCAGCTTTCATCAACA | 5' mRNA | |
lacZ12 | AATAATTCGCGTCTGGCCTT | 5' mRNA | |
lacZ13 | AGATGAAACGCCGAGTTAAC | 5' mRNA | |
lacZ14 | AATTCAGACGGCAAACGACT | 5' mRNA | |
lacZ15 | TTTCTCCGGCGCGTAAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ16 | ATCTTCCAGATAACTGCCGT | 5' mRNA | |
lacZ17 | AACGAGACGTCACGGAAAAT | 5' mRNA | |
lacZ18 | GCTGATTTGTGTAGTCGGTT | 5' mRNA | |
lacZ19 | TTAAAGCGAGTGGCAACATG | 5' mRNA | |
lacZ20 | AACTGTTACCCGTAGGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ21 | ATAATTTCACCGCCGAAAGG | 5' mRNA | |
lacZ22 | TTTCGACGTTCAGACGTAGT | 5' mRNA | |
lacZ23 | ATAGAGATTCGGGATTTCGG | 5' mRNA | |
lacZ24 | TTCTGCTTCAATCAGCGTGC | 5' mRNA | |
lacZ25 | ACCATTTTCAATCCGCACCT | ||
lacZ26 | TTAACGCCTCGAATCAGCAA | ||
lacZ27 | ATGCAGAGGATGATGCTCGT | ||
lacZ28 | TCTGCTCATCCATGACCTGA | ||
lacZ29 | TTCATCAGCAGGATATCCTG | ||
lacZ30 | CACGGCGTTAAAGTTGTTCT | ||
lacZ31 | TGGTTCGGATAATGCGAACA | ||
lacZ32 | TTCATCCACCACATACAGGC | ||
lacZ33 | TGCCGTGGGTTTCAATATTG | ||
lacZ34 | ATCGGTCAGACGATTCATTG | ||
lacZ35 | TGATCACACTCGGGTGATTA | ||
lacZ36 | ATACAGCGCGTCGTGATTAG | ||
lacZ37 | GATCGACAGATTTGATCCAG | ||
lacZ38 | AAATAATATCGGTGGCCGTG | ||
lacZ39 | TTTGATGGACCATTTCGGCA | ||
lacZ40 | TATTCGCAAAGGATCAGCGG | ||
lacZ41 | AAGACTGTTACCCATCGCGT | ||
lacZ42 | TGCCAGTATTTAGCGAAACC | ||
lacZ43 | AAACGGGGATACTGACGAAA | ||
lacZ44 | TAATCAGCGACTGATCCACC | ||
lacZ45 | GGGTTGCCGTTTTCATCATA | ||
lacZ46 | TCGGCGTATCGCCAAAATCA | ||
lacZ47 | TTCATACAGAACTGGCGATC | ||
lacZ48 | TGGTGTTTTGCTTCCGTCAG | ||
lacZ49 | ACGGAACTGGAAAAACTGCT | 3' mRNA | |
lacZ50 | TATTCGCTGGTCACTTCGAT | 3' mRNA | |
lacZ51 | GTTATCGCTATGACGGAACA | 3' mRNA | |
lacZ52 | TTTACCTTGTGGAGCGACAT | 3' mRNA | |
lacZ53 | GTTCAGGCAGTTCAATCAAC | 3' mRNA | |
lacZ54 | TTGCACTACGCGTACTGTGA | 3' mRNA | |
lacZ55 | AGCGTCACACTGAGGTTTTC | 3' mRNA | |
lacZ56 | ATTTCGCTGGTGGTCAGATG | 3' mRNA | |
lacZ57 | ACCCAGCTCGATGCAAAAAT | 3' mRNA | |
lacZ58 | CGGTTAAATTGCCAACGCTT | 3' mRNA | |
lacZ59 | CTGTGAAAGAAAGCCTGACT | 3' mRNA | |
lacZ60 | GGCGTCAGCAGTTGTTTTTT | 3' mRNA | |
lacZ61 | TACGCCAATGTCGTTATCCA | 3' mRNA | |
lacZ62 | TAAGGTTTTCCCCTGATGCT | 3' mRNA | |
lacZ63 | ATCAATCCGGTAGGTTTTCC | 3' mRNA | |
lacZ64 | GTAATCGCCATTTGACCACT | 3' mRNA | |
lacZ65 | AGTTTTCTTGCGGCCCTAAT | 3' mRNA | |
lacZ66 | ATGTCTGACAATGGCAGATC | 3' mRNA | |
lacZ67 | ATAATTCAATTCGCGCGTCC | 3' mRNA | |
lacZ68 | TGATGTTGAACTGGAAGTCG | 3' mRNA | |
lacZ69 | TCAGTTGCTGTTGACTGTAG | 3' mRNA | |
lacZ70 | ATTCAGCCATGTGCCTTCTT | 3' mRNA | |
lacZ71 | AATCCCCATATGGAAACCGT | 3' mRNA | |
lacZ72 | AGACCAACTGGTAATGGTAG | 3' mRNA |