ثقافة الخلايا العصبية المشتقة من المنافذ العصبية في الكبار فولز
Summary
أنشأنا الظروف لثقافة الخلايا السلف العصبي من المنطقة دون البطينية و gyrus dentate من الدماغ الكبار من فولز، كدراسة تكميلية في المختبر، لتحليل الاختلافات التي تعتمد على الجنس بين المنافذ العصبية التي يمكن أن تكون جزءا من التغييرات البلاستيكية الوظيفية المرتبطة بالسلوكيات الاجتماعية.
Abstract
المغنطيس العصبي هي مجاميع الخلايا الأولية التي تضم الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف. هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد هي أداة ممتازة لتحديد التمايز واحتمالات الانتشار للخلايا الجذعية العصبية ، وكذلك لتوليد خطوط الخلايا مما يمكن أن يكون مقايسة مع مرور الوقت. أيضا، يمكن أن تخلق neurospheres مكانة (في المختبر) الذي يسمح نموس بيئة متغيرة ديناميكية، مثل عوامل النمو المختلفة، والهرمونات، والناقلات العصبية، من بين أمور أخرى. ميكروتوس ochrogaster (المرج فول) هو نموذج فريد لفهم الأساس العصبي البيولوجي للسلوكيات الاجتماعية والجنسية والإدراك الاجتماعي. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية المشاركة في هذه السلوكيات ليست معروفة جيدا. ويهدف البروتوكول إلى الحصول على خلايا السلف العصبي من محاريب عصبية من فول البراري الكبار، التي يتم استزراعها في ظل ظروف غير منسجمة، لتوليد الخلايا العصبية. يعتمد حجم وعدد الخلايا العصبية على المنطقة (المنطقة دون البطينية أو الجيروسكوبات) وجنس المرج. هذه الطريقة هي أداة رائعة لدراسة الاختلافات المعتمدة على الجنس في المنافذ العصبية في المختبر وتغيرات المرونة العصبية المرتبطة بالسلوكيات الاجتماعية مثل الترابط بين الزوجين والرعاية بين الوالدين. أيضا، يمكن فحص الظروف المعرفية التي تنطوي على العجز في التفاعلات الاجتماعية (اضطرابات طيف التوحد والفصام).
Introduction
و vole المرج(ميكروتوس ochrogaster)، وهو عضو في الأسرة Cricetidae ، هو الثدييات الصغيرة التي تتطور استراتيجية الحياة كنوع أحادية الزواج اجتماعيا ومؤنس للغاية. كل من الذكور والإناث إقامة علاقة الزوج دائم بعد التزاوج أو فترات طويلة من التعايش التي تتميز تقاسم العش، والدفاع عن أراضيهم، وعرض الرعاية بين الوالدين لذريتهم1،2،3،4. وهكذا، فإن المرج فول هو نموذج قيم لفهم الأساس العصبي البيولوجي للسلوك الاجتماعي والجنسي والعاهات في الإدراك الاجتماعي5.
النشوء العصبي للبالغين هي واحدة من العمليات الأكثر أهمية لللدونة العصبية التي تؤدي إلى تغييرات سلوكية. على سبيل المثال، ذكرت مجموعتنا البحثية في ذكور أن التعايش الاجتماعي مع التزاوج يزيد من انتشار الخلايا في المنطقة دون البطينية (VZ) والمنطقة دون الرعية في الجيروسكوب (DG) من قرن آمون، مما يشير إلى أن التكاثر العصبي للبالغين يمكن أن يلعب دورًا في تكوين الترابط الناجم عن التزاوج في البراري (البيانات غير المنشورة). من ناحية أخرى، على الرغم من أن مناطق الدماغ حيث يتم توليد الخلايا العصبية الجديدة ومتكاملة معروفة جيدا، والآليات الجزيئية والخلوية المشاركة في هذه العمليات لا تزال غير محددة بسبب العيوب التقنية في نموذج الدماغ كله6. على سبيل المثال، مسارات الإشارة التي تتحكم في التعبير الجيني والأنشطة الخلوية الأخرى لها فترة تنشيط قصيرة نسبيا (الكشف عن phosphoproteome)7. نموذج بديل واحد هو الخلايا الجذعية العصبية البالغة المعزولة والمزاجة أو الخلايا السلف لتوضيح المكونات الجزيئية المشاركة في تكوين الأعصاب للبالغين.
كان النهج الأول للحفاظ على السلائف العصبية في المختبر من الثدييات البالغة (الفأرة) الدماغ هو مقايسة من الخلايا العصبية ، والتي هي المجاميع الخلوية التي تنمو في ظل ظروف غير مطيعة التي تحافظ على إمكاناتها متعددة القدرات لتوليد الخلايا العصبية ، وكذلك الخلايا الفلكية8،9،10. خلال تطورها، وهناك عملية اختيار حيث السلائف فقط سوف تستجيب لميوجين مثل عامل النمو البشرة (EGF) وعامل النمو الليفي 2 (FGF2) لتكاثر وتوليد الخلايا العصبية8،9،10.
على حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن أي بروتوكول في الأدب للحصول على السلف العصبية الكبار من voles. هنا، أنشأنا ظروف الثقافة لعزل السلف العصبية من المنافذ العصبية وصيانة في المختبر من خلال فحص تشكيل الغلاف العصبي. وهكذا، يمكن تصميم التجارب لتحديد الآليات الجزيئية والخلوية التي تشارك في انتشار وهجرة وتمايز وبقاء الخلايا الجذعية العصبية وذرية، وهي عمليات لا تزال غير معروفة في المرج. وعلاوة على ذلك، يمكن توضيح الاختلافات في المختبر في خصائص الخلايا المستمدة من VZ وDG تقديم معلومات حول دور المنافذ العصبية في اللدونة العصبية المرتبطة بالتغيرات في السلوك الاجتماعي والجنسي والسلوكيات المعرفية، والعجز في التفاعلات الاجتماعية (اضطراب طيف التوحد والفصام)، والتي يمكن أن تكون أيضا تعتمد على الجنس.
Protocol
Representative Results
Discussion
مرحلة للحصول على ثقافة الخلايا الجذعية العصبية هي فترة الهضم مع محلول انزيمي، والتي يجب ألا تتجاوز أكثر من 30 دقيقة لأنها قد تقلل من صلاحية الخلية. وينبغي أن تظهر في 8-10 أيام من الاستزراع الأولي. إذا لم تظهر في اليوم 12 ، وتجاهل الثقافة وتكرار التجربة ، والحد من فترة الهضم. وثمة مسألة أخرى هي ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا البحث من المنح الوطنية الوطنية 252756 و253631؛ UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 و IN203518; INPER 2018-1-163، وNIH P51OD11132. ونشكر ديسي غاسكا، وكارلوس لوزانو، ومارتين غارسيا، وألياندرا كاستيا، ونيديا هرنانديز، وجيسيكا نوريس، وسوزانا كاسترو على مساعدتهم التقنية الممتازة.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
