Cultuur van neurosferen afgeleid van de neurogene niches in Adult Prairie Voles
Summary
We stelden de voorwaarden voor de cultuur neurale voorloper cellen uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van de volwassen hersenen van prairie voles, als een aanvullende in vitro studie, om de seks-afhankelijke verschillen tussen neurogene niches die deel kunnen uitmaken van functionele plastic veranderingen in verband met sociaal gedrag te analyseren.
Abstract
Neurosferen zijn primaire celaggregaten die neurale stamcellen en voorlopercellen omvatten. Deze 3D-structuren zijn een uitstekend hulpmiddel om de differentiatie en proliferatie potentieel van neurale stamcellen te bepalen, evenals om cellijnen te genereren dan kan worden onderzocht na verloop van tijd. Ook kunnen neurosferen een niche (in vitro) creëren die het mogelijk maakt om de dynamische veranderende omgeving te modelleren, zoals verschillende groeifactoren, hormonen, neurotransmitters, onder andere. Microtus ochrogyster (prairie vole) is een uniek model voor het begrijpen van de neurobiologische basis van sociaal-seksueel gedrag en sociale cognitie. Echter, de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij dit gedrag zijn niet bekend. Het protocol is bedoeld om neurale voorlopercellen te verkrijgen uit de neurogene niches van de volwassen prairievole, die worden gekweekt onder niet-aanhangende omstandigheden, om neurosferen te genereren. De grootte en het aantal neurosferen zijn afhankelijk van de regio (subventriculaire zone of dentate gyrus) en het geslacht van de prairievole. Deze methode is een opmerkelijk hulpmiddel om geslachtsafhankelijke verschillen in neurogene niches in vitro en de neuroplasticiteitsveranderingen in verband met sociaal gedrag zoals pairbinding en biparentale zorg te bestuderen. Ook cognitieve aandoeningen die leiden tot tekorten in sociale interacties (autisme spectrum stoornissen en schizofrenie) kunnen worden onderzocht.
Introduction
De prairie vole (Microtus ochrogrogaster), een lid van de Cricetidae familie, is een klein zoogdier waarvan de levensstrategie zich ontwikkelt als een sociaal monogame en zeer gezellige soort. Zowel mannen als vrouwen vestigen een blijvende paarband na de paring of lange perioden van samenwonen die worden gekenmerkt door het delen van het nest, het verdedigen van hun grondgebied en het tonen van biparentale zorg voor hun nageslacht1,2,3,4. Zo is de prairie vole een waardevol model voor het begrijpen van de neurobiologische basis van sociaal-seksueel gedrag en beperkingen in sociale cognitie5.
Volwassen neurogenese is een van de meest belangrijke processen van neurale plasticiteit die leidt tot gedragsveranderingen. Bijvoorbeeld, onze onderzoeksgroep gemeld in mannelijke woelmuis dat sociale samenwonen met paring verhoogde cel proliferatie in de subventriculaire zone (VZ) en subgranulaire zone in de dentate gyrus (DG) van de hippocampus, wat suggereert dat volwassen neurogenese kan een rol spelen in de vorming van paar binding veroorzaakt door paring in prairie voles (ongepubliceerde gegevens). Aan de andere kant, hoewel de hersengebieden waar nieuwe neuronen worden gegenereerd en geïntegreerd bekend zijn, blijven de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij deze processen onbepaald vanwege technische nadelen in het hele hersenmodel6. Zo hebben de signaleringstrajecten die de genexpressie en andere cellulaire activiteiten controleren een relatief korte activeringsperiode (detectie van fosfoprotenoom)7. Een alternatief model is geïsoleerd en gekweekte volwassen neurale stamcellen of voorloper cellen om moleculaire componenten die betrokken zijn bij volwassen neurogenese op te helderen.
De eerste benadering om in vitro neurale precursoren uit volwassen zoogdier (muis) hersenen te handhaven was de test van neurosferen, die cellulaire aggregaten groeien onder niet-aanhangende omstandigheden die hun multipotente potentieel om neuronen te genereren behouden,evenalsastrocyten 8,9,10. Tijdens hun ontwikkeling is er een selectieproces waarbij alleen de precursoren zullen reageren op mitogenen zoals de Epidermal Growth Factor (EFG) en Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) om neurosferen te vermenigvuldigen en neurosferen te genereren8,9,10.
Voor zover wij weten, wordt er geen protocol gemeld in de literatuur om volwassen neurale voorouders te verkrijgen van prairiewinnen. Hier hebben we de kweekomstandigheden vastgesteld om neuronale voorouders te isoleren van neurogene niches en hun in vitro onderhoud via de neurosfeervormingstest. Zo kunnen experimenten worden ontworpen om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij proliferatie, migratie, differentiatie en overleving van de neurale stamcellen en voorouders, processen die nog onbekend zijn in de prairie vole te identificeren. Bovendien zou het ophelderen van in vitro verschillen in de eigenschappen van de cellen afgeleid van de VZ en DG informatie kunnen verschaffen over de rol van neurogene niches in neurale plasticiteit geassocieerd met veranderingen in sociaal-seksueel gedrag en cognitief gedrag, en tekorten in sociale interacties (autismespectrumstoornis en schizofrenie), die ook seksafhankelijk kunnen zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een stadium om een neurale stamcelcultuur te verkrijgen is de spijsverteringsperiode met de enzymatische oplossing, die niet meer dan 30 min mag bedragen omdat het de levensvatbaarheid van cellen zou kunnen verminderen. De neurosferen moeten ontstaan op 8-10 dagen na de eerste cultuur; als ze niet op dag 12 tevoorschijn komen, gooi de cultuur weg en herhaal het experiment, waardoor de spijsverteringsperiode wordt verkort. Een ander probleem is de bloedvaten die betrekking hebben op het hersenweefsel. Ze moeten volledig w…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies CONACYT 252756 en 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 en IN203518; INPER 2018-1-163 en NIH P51OD11132. Wij danken Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris en Susana Castro voor hun uitstekende technische bijstand.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
- Portillo, W., Paredes, R. G. Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals. Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).
- Walum, H., Young, L. J. The neural mechanisms and circuitry of the pair bond. Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).
- Gobrogge, K. L. Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles. Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).
- Perkeybile, A. M., Bales, K. L. Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species. Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).
- McGraw, L. A., Young, L. J. The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain. Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).
- Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole. Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).
- Yang, P., et al. Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency. Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).
- Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells. Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).
- Paxinos, G., Keith, B. J. F. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).
- Conti, L., Cattaneo, E. Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities. Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).
- Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles. Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).
- Ruscio, M. G., et al. Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole. Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).
- Wojtowicz, J. M., Kee, N. BrdU assay for neurogenesis in rodents. Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).
- Eack, S. M., et al. Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia. Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).
- Pinkham, A. E., et al. Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia. Psychological Medicine. , 1-9 (2019).
- Yirmiya, N., et al. Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills. Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).
- Montag, C., et al. Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study. The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).
- Harony, H., Wagner, S. The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder. Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).
- Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors. Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).
- Wegiel, J., et al. The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes. Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).
- Kaushik, G., Zarbalis, K. S. Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders. Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).
- Sheu, J. R., et al. A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).
- Donaldson, Z. R., Young, L. J. The relative contribution of proximal 5′ flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior. PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).
- Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster). Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).
