成人大草原の神経起源ニッチ由来の神経球の培養
Summary
我々は、社会行動に関連する機能的プラスチック変化の一部となり得る神経原性ニッチ間の性依存性差を分析するために、大草原の渦の脳の脳下脳領域および脳内胞から神経前駆細胞を培養する条件を確立した。
Abstract
神経球は、神経幹細胞と前駆細胞を含む一次細胞凝集体である。これらの3D構造は、神経幹細胞の分化および増殖の可能性を決定し、時間をかけてアッセイできるよりも細胞株を生成するための優れたツールです。また、神経球は、様々な成長因子、ホルモン、神経伝達物質などの動的変化環境のモデリングを可能にするニッチ(インビトロ)を作成することができます。 マイクロタス・オクロガスター (大草原のボレ)は、社会性行動と社会的認知の神経生物学的基礎を理解するためのユニークなモデルです。しかし、これらの行動に関与する細胞機構は、よく知られていない。このプロトコルは、非接着条件下で培養される成体大草原の神経原性ニッチから神経前駆細胞を得て、神経球を生成することを目的としている。神経球の大きさと数は、領域(脳室内領域またはデンテート回)および大草原の性別に依存する。この方法は、インビトロにおける神経原性ニッチの性依存性に依存する違いを研究するための顕著なツールであり、ペアボンディングおよびバイペアペアケアなどの社会的行動に関連する神経可塑性の変化である。また、社会的相互作用(自閉症スペクトラム障害および統合失調症)の欠損を伴う認知状態を調べることができる。
Introduction
クリセチダ科の一員である大草原のボレ(ミクロトゥス・オクロガスター)は、社会的に一夫一婦制で社交的な種として生命戦略が発展する小さな哺乳類です。男性と女性の両方が交配後または同棲の長い期間の後に永続的なペアの絆を確立し、巣を共有し、自分の領土を守り、子孫1、2、3、4のための二人の世話を表示することを特徴とする。このように、大草原のボレは、社会認知における社会性行動および障害の神経生物学的基礎を理解するための貴重なモデルである5。
成人の神経新生は、行動の変化につながる神経可塑性の最も重要なプロセスの一つです。例えば、我々の研究グループは、海馬の脳内胞領域(VZ)および樹状回(DG)における脳室領域(VZ)およびサブ顆粒帯における交配との社会的同居が、大草原の交配によって誘発される対結合の形成に役割を果たすことができることを示唆している男性のボルで報告した(未発表データ)。一方、新しいニューロンが生成され、統合された脳領域はよく知られているが、これらのプロセスに関与する分子および細胞機構は、脳モデル6全体の技術的な欠点のために未確定のままである。例えば、遺伝子発現および他の細胞活動を制御するシグナル伝達経路は、比較的短い活性化期間(ホスホプロテオームの検出)7を有する。代替モデルの1つは、成人神経新生に関与する分子成分を解明するために、単離された、培養された成体神経幹細胞または前駆細胞である。
成人哺乳類(マウス)脳からのインビトロ神経前駆体を維持するための最初のアプローチは、神経球のアッセイであり、これは、ニューロンを生成する多能性の可能性を維持する非接着条件下で成長する細胞凝集体であり、アストロサイト8、9、10であった。その開発の間に、前駆体だけが上皮成長因子(EGF)や線維芽細胞成長因子2(FGF2)などの有糸原物質に反応して神経球8、9、10を増殖させ、生成する選択プロセスがある。
我々の知る限りでは、大草原から成体神経前駆物質を得るためのプロトコルは文献に報告されていない。ここでは、神経球形成アッセイを通じて神経原性ニッチとそのインビトロ維持から神経前駆細胞を分離する培養条件を確立した。したがって、実験は、増殖、移動、分化および前駆体の神経幹細胞および前駆細胞の生存に関与する分子および細胞のメカニズムを同定するために設計されることができ、大草原の中でまだ知られていないプロセスである。さらに、VZおよびDGに由来する細胞の特性のインビトロの違いを解明することは、社会性行動および認知行動の変化に関連する神経可塑性における神経原性ニッチの役割に関する情報を提供し、性依存性依存性に依存する可能性のある社会的相互作用(自閉症スペクトラム障害および統合失調症)の欠損に関する情報を提供する可能性がある。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経幹細胞培養を得る段階は酵素溶液による消化期間であり、細胞の生存率を低下させる可能性があるため、30分を超えてはならない。神経球は、最初の培養後8〜10日で出現するはずです。12日目までに出現しない場合は、培養を捨てて実験を繰り返し、消化期間を短縮する。もう一つの問題は、脳組織をカバーする血管です。赤血球の過剰が神経球形成を妨げる可能性があるため、解剖中に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、CONACYT 252756および253631の助成金によって支えられた。ウナム-ダパ-パピット IN202818 および IN203518;INPER 2018-1-163、およびNIH P51OD11132。デイジー・ガスカ、カルロス・ロザーノ、マルティン・ガルシア、アレハンドラ・カスティーリャ、ニディア・ヘルナンデス、ジェシカ・ノリス、スサナ・カストロの技術支援に感謝します。
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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