Culture des neurosphères dérivées des niches neurogéniques des campagnols adultes des Prairies
Summary
Nous avons établi les conditions de culture des cellules progénitrices neurales de la zone sous-ventriculaire et de la bosseler le gyrus du cerveau adulte des campagnols des Prairies, en tant qu’étude in vitro complémentaire, pour analyser les différences dépendantes du sexe entre les niches névrogènes qui pourraient faire partie des changements plastiques fonctionnels associés aux comportements sociaux.
Abstract
Les neurosphères sont des agrégats cellulaires primaires qui comprennent des cellules souches neurales et des cellules progénitrices. Ces structures 3D sont un excellent outil pour déterminer le potentiel de différenciation et de prolifération des cellules souches neurales, ainsi que pour générer des lignées cellulaires que l’on peut trouver au fil du temps. En outre, les neurosphères peuvent créer un créneau (in vitro) qui permet la modélisation de l’environnement dynamique changeant, tels que divers facteurs de croissance, hormones, neurotransmetteurs, entre autres. Microtus ochrogaster (campagnol des Prairies) est un modèle unique pour comprendre la base neurobiologique des comportements socio-sexuels et de la cognition sociale. Cependant, les mécanismes cellulaires impliqués dans ces comportements ne sont pas bien connus. Le protocole vise à obtenir des cellules progénitrices neurales des niches névrogènes du campagnol adulte des Prairies, qui sont cultivés dans des conditions non adhérentes, pour générer des neurosphères. La taille et le nombre de neurosphères dépendent de la région (zone subventriculaire ou gyrus bosselé) et du sexe du campagnol des Prairies. Cette méthode est un outil remarquable pour étudier les différences sexo-dépendantes dans les niches névrogènes in vitro et les changements de neuroplasticité associés aux comportements sociaux tels que la liaison de paire et les soins biparentaux. En outre, les conditions cognitives qui entraînent des déficits dans les interactions sociales (troubles du spectre autistique et schizophrénie) pourraient être examinées.
Introduction
Le campagnol des Prairies (Microtus ochrogaster), un membre de la famille cricetidae, est un petit mammifère dont la stratégie de vie se développe comme une espèce socialement monogame et très sociable. Les mâles et les femelles établissent un lien de couple durable après l’accouplement ou de longues périodes de cohabitation caractérisées par le partage du nid, la défense de leur territoire, et l’affichage de soins biparentaux pour leurprogéniture 1,2,3,4. Ainsi, le campagnol de prairie est un modèle valable pour comprendre la base neurobiologique du comportement socio-sexuel et des affaiblissements dans la cognition sociale5.
La neurogenèse adulte est l’un des processus les plus primordiaux de la plasticité neuronale qui conduit à des changements comportementaux. Par exemple, notre groupe de recherche a signalé chez les campagnols mâles que la cohabitation sociale avec l’accouplement augmentait la prolifération cellulaire dans la zone sous-ventriculaire (ZV) et la zone subgranulaire dans le gyrus bosselé (DG) de l’hippocampe, ce qui suggère que la neurogenèse adulte peut jouer un rôle dans la formation de liaisons en couple induites par l’accouplement dans les campagnols des Prairies (données non publiées). D’autre part, bien que les régions du cerveau où de nouveaux neurones sont générés et intégrés sont bien connues, les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans ces processus restent indéterminés en raison des inconvénients techniques dans l’ensemble du modèlecérébral 6. Par exemple, les voies de signalisation contrôlant l’expression des gènes et d’autres activités cellulaires ont une période d’activation relativement courte (détection du phosphoprotéome)7. Un modèle alternatif est des cellules souches neurales adultes isolées et cultivés ou des cellules progénitrices pour élucider les composants moléculaires impliqués dans la neurogenèse adulte.
La première approche pour maintenir les précurseurs neuronaux in vitro du cerveau adulte de mammifère (souris) a été l’essai des neurosphères, qui sont des agrégats cellulaires se développent dans des conditions non adhérentes qui préservent leur potentiel multipotent pour générer des neurones, aussi bien que des astrocytes8,9,10. Au cours de leur développement, il existe un processus de sélection où seuls les précurseurs répondront aux mitogènes tels que le facteur de croissance épidermique (FEM) et le facteur de croissance fibroblaste 2 (FGF2) pour proliférer et générer des néorosphères8,9,10.
À notre connaissance, aucun protocole n’est rapporté dans la littérature pour obtenir des progéniteurs neuronaux adultes des campagnols des Prairies. Ici, nous avons établi les conditions de culture pour isoler les progéniteurs neuronaux des niches névrogènes et de leur entretien in vitro par l’essai de formation de neurosphère. Ainsi, les expériences peuvent être conçues pour identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la prolifération, la migration, la différenciation et la survie des cellules souches neurales et des progéniteurs, processus encore inconnus dans le campagnol des Prairies. En outre, l’élucidation des différences in vitro dans les propriétés des cellules dérivées de la ZV et de la DG pourrait fournir des informations sur le rôle des niches névrogènes dans la plasticité neuronale associée aux changements dans le comportement socio-sexuel et les comportements cognitifs, et les déficits dans les interactions sociales (troubles du spectre autistique et schizophrénie), qui pourraient également être dépendants du sexe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une étape pour obtenir une culture neurale de cellules souches est la période de digestion avec la solution enzymatique, qui ne devrait pas dépasser plus de 30 min parce qu’elle pourrait diminuer la viabilité cellulaire. Les neurosphères devraient émerger à 8-10 jours après la culture initiale ; s’ils n’émergent pas au jour 12, jetez la culture et répétez l’expérience, réduisant ainsi la période de digestion. Un autre problème est les vaisseaux sanguins qui couvrent le tissu cérébral. Ils doivent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été appuyée par des subventions CONACYT 252756 et 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT EN 202818 et IN203518; INPER 2018-1-163, et NIH P51OD11132. Nous remercions Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris et Susana Castro pour leur excellente assistance technique.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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