Kultur der Neurosphären Abgeleitet von den neurogenen Nischen in Adult Prairie Voles
Summary
Wir etablierten die Bedingungen zur Kultur neuronaler Vorläuferzellen aus der subventrikulären Zone und dentate Gyrus des erwachsenen Gehirns von Präriewühlmäusen, als ergänzende In-vitro-Studie, um die geschlechtsabhängigen Unterschiede zwischen neurogenen Nischen zu analysieren, die Teil funktioneller plastischer Veränderungen sein könnten, die mit sozialen Verhaltensweisen verbunden sind.
Abstract
Neurosphären sind primäre Zellaggregate, die neuronale Stammzellen und Vorläuferzellen umfassen. Diese 3D-Strukturen sind ein ausgezeichnetes Werkzeug, um das Differenzierungs- und Proliferationspotenzial neuronaler Stammzellen zu bestimmen und Zelllinien zu erzeugen, die im Laufe der Zeit untersucht werden können. Auch Neurosphären können eine Nische (in vitro) schaffen, die die Modellierung der dynamischen Veränderung sende Umgebung ermöglicht, wie verschiedene Wachstumsfaktoren, Hormone, Neurotransmitter, unter anderem. Microtus ochrogaster (Präriewühlmaus) ist ein einzigartiges Modell zum Verständnis der neurobiologischen Grundlagen sozio-sexueller Verhaltensweisen und sozialer Kognition. Jedoch, die zellulären Mechanismen in diesen Verhaltensweisen beteiligt sind nicht gut bekannt. Das Protokoll zielt darauf ab, neuronale Vorläuferzellen aus den neurogenen Nischen der erwachsenen Präriewühlmaus zu erhalten, die unter nicht anhaftenden Bedingungen kultiviert werden, um Neurosphären zu erzeugen. Die Größe und Anzahl der Neurosphären hängt von der Region (subventrikuläre Zone oder Dentate Gyrus) und Geschlecht der PrärieWühlmaus ab. Diese Methode ist ein bemerkenswertes Werkzeug, um geschlechtsabhängige Unterschiede in neurogenen Nischen in vitro und die Neuroplastizitätsänderungen im Zusammenhang mit sozialen Verhaltensweisen wie Paarbindung und biparentaler Pflege zu untersuchen. Auch kognitive Bedingungen, die Defizite in sozialen Interaktionen (Autismus-Spektrum-Störungen und Schizophrenie) mit sich bringen, könnten untersucht werden.
Introduction
Die Präriewühlmaus(Microtus ochrogaster), ein Mitglied der Familie der Cricetidae, ist ein kleines Säugetier, dessen Lebensstrategie sich als sozial monogame und hochgesellige Spezies entwickelt. Sowohl Männchen als auch Weibchen stellen eine dauerhafte Paarbindung nach der Paarung oder lange Zeiträume des Zusammenlebens durch die gemeinsame Nutzung des Nestes, Die Verteidigung ihres Territoriums, und die Darstellung biparentalpflegefürsorge für ihre Nachkommen1,2,3,4. Somit ist die Präriewühlmaus ein wertvolles Modell für das Verständnis der neurobiologischen Grundlagen des sozio-sexuellen Verhaltens und der Beeinträchtigungen der sozialen Wahrnehmung5.
Die adulte Neurogenese ist einer der wichtigsten Prozesse der neuronalen Plastizität, die zu Verhaltensänderungen führt. Zum Beispiel berichtete unsere Forschungsgruppe bei männlichen Wühlmäusen, dass das soziale Zusammenleben mit der Paarung die Zellproliferation in der subventrikulären Zone (VZ) und der subgranularen Zone im Dentate Gyrus (DG) des Hippocampus erhöht, was darauf hindeutet, dass die adulte Neurogenese eine Rolle bei der Bildung von Paarbindung spielen kann, die durch Paarung in Präriewühlmäusen induziert wird (unveröffentlichte Daten). Auf der anderen Seite sind zwar die Hirnregionen, in denen neue Neuronen erzeugt und integriert werden, bekannt, aber die molekularen und zellulären Mechanismen, die an diesen Prozessen beteiligt sind, bleiben aufgrund technischer Nachteile im gesamten Gehirnmodell6unbestimmt. Zum Beispiel haben die Signalwege, die die Genexpression steuern, und andere zelluläre Aktivitäten eine relativ kurze Aktivierungszeit (Nachweis von Phosphoproteome)7. Ein alternatives Modell sind isolierte und kultivierte adulte neuronale Stammzellen oder Vorläuferzellen, um molekulare Komponenten aufzuklären, die an der adulten Neurogenese beteiligt sind.
Der erste Ansatz zur Aufrechterhaltung von in vitro neuronalen Vorläufern aus erwachsenen Säugetieren (Maus) Gehirn war der Assay von Neurosphären, die zelluläre Aggregate sind, die unter nicht-anhaftenden Bedingungen wachsen, die ihr multipotentes Potenzial zur Erzeugung von Neuronen, sowie Astrozyten8,9,10bewahren. Während ihrer Entwicklung gibt es ein Auswahlverfahren, bei dem nur die Vorläufer auf Mitogene wie epidermal growth Factor (EGF) und Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) reagieren, um sich zu vermehren und Neurosphären8,9,10zu erzeugen.
Nach unserem Wissen wird in der Literatur kein Protokoll berichtet, um erwachsene neuronale Vorfahren aus Präriewühlmäusen zu erhalten. Hier haben wir die Kulturbedingungen geschaffen, um neuronale Vorläufer aus neurogenen Nischen und deren In-vitro-Pflege durch den Neurosphärenbildungstest zu isolieren. So können Experimente entwickelt werden, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu identifizieren, die an der Proliferation, Migration, Differenzierung und überleben der neuronalen Stammzellen und Vorläufer beteiligt sind, Prozesse, die in der Präriewühlmaus noch unbekannt sind. Darüber hinaus könnte die Aufklärung von In-vitro-Unterschieden in den Eigenschaften der Zellen, die von der VZ und der GD abgeleitet wurden, Informationen über die Rolle neurogener Nischen in der neuronalen Plastizität liefern, die mit Veränderungen des sozio-sexuellen Verhaltens und kognitiven Verhaltens verbunden sind, und Defizite in sozialen Interaktionen (Autismus-Spektrum-Störung und Schizophrenie), die auch geschlechtsabhängig sein könnten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Stadium, um eine neuronale Stammzellkultur zu erhalten, ist die Verdauungsphase mit der enzymatischen Lösung, die nicht mehr als 30 min überschreiten sollte, da sie die Zelllebensfähigkeit verringern könnte. Die Neurosphären sollten 8-10 Tage nach der Ursprünglichen Kultur entstehen; wenn sie nicht am 12. Tag auftauchen, entsorgen Sie die Kultur und wiederholen Sie das Experiment, wodurch die Verdauungszeit verkürzt wird. Ein weiteres Problem sind die Blutgefäße, die das Gehirngewebe bedecken. Sie sollten w?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die Stipendien CONACYT 252756 und 253631 unterstützt; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 und IN203518; INPER 2018-1-163 und NIH P51OD11132. Wir danken Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martin Garcia, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris und Susana Castro für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung.
Materials
| Antibodies | Antibody ID | ||
| Anti-Nestin | GeneTex | GTX30671 | RRID:AB_625325 |
| Anti-Doublecortin | MERCK | AB2253 | RRID:AB_1586992 |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab66155 | RRID:AB_1140752 |
| Anti-MAP2 | GeneTex | GTX50810 | RRID:AB_11170769 |
| Anti-GFAP | SIGMA | G3893 | RRID:AB_477010 |
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11029 | RRID:AB_2534088 |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11036 | RRID:AB_10563566 |
| Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11073 | RRID:AB_2534117 |
| Culture reagents | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 15240062 | 100X |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17504044 | 50X |
| Collagenase, Type IV | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17104019 | Powder |
| Dispase | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17105041 | Powder |
| DMEM/F12, HEPES | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 11330032 | |
| Glucose | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 35050061 | 100X |
| HEPES | any brand | Powder, Cell Culture Grade | |
| Mouse Laminin | Corning | 354232 | 1 mg/mL |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 17502048 | 100X |
| NAHCO3 | any brand | Powder, Suitable for Cell Culture | |
| Neurobasal | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 21103049 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific/Gibco | 10010023 | 1X |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | Powder |
| Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | AF-100-18B | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Thermo Fisher Scientific/Gibco | A1110501 | 100 mL |
| Disposable material | |||
| 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3473 | |
| 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates | Corning/Costar | 3526 | |
| 40 µm Cell Strainer | Corning/Falcon | 352340 | Blue |
| Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 µm pore | Corning | 431118 | PES membrane, 45 mm diameter neck |
| Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube | any brand | with conical bottom | |
| Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 µl, 200 µl and 10 µl. | any brand | ||
| Sterile cotton gauzes | |||
| Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL | any brand | ||
| Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL | any brand | ||
| Sterile surgical gloves | any brand | ||
| Syringe Filters, 0.22 µm pore | Merk Millipore | SLGPR33RB | Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter |
| Equipment and surgical instruments | |||
| Biological safety cabinet | |||
| Dissecting Scissors | |||
| Dumont Forceps | |||
| Motorized Pipet Filler/Dispenser | |||
| Micropipettes | |||
| Petri Dishes | |||
| Scalpel Blades | |||
| Stainless-steel Spatula |
References
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