ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

כל ההליכים הבאים היו בהתאם לסטנדרטים האתיים של ועדת האתיקה של המחקר האנושי של המוסדות. המחקר אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית בבית החולים Shizuoka של אוניברסיטת ג’ונטנדו, והסכמה מדעת בכתב נדחתה בגלל העיצוב הרטרוספקטיבי. 1. שטיפת השקופיות הכן 10 מיקרומטר של מקטעי פרפין-מוטבעים (FFPE) לא נגועים בפרלין קבוע. מקם שקופיות במחזיק שקופיות מזכוכית: השתמש בכ- 3-5 השקופיות חתונות הגדולות ביותר אלא אם כן הרקמה מינימלית ויש צורך בשקופיות נוספות. מלא את מחזיק השקופיות ב- xylene וודא שכל הרקמה בשקופית שקועה. אפשר לשבת במשך 15 דקות. לאחר 15 דקות, יוצקים את הקסילן עם השקופיות מוחזקות עם קצה פיפטה, כך השקופיות לא לנשור. יוצקים עוד קסילן לאותה רמה כמו קודם. אפשר לשבת עוד 15 דקות. לאחר 15 דקות, לשפוך את הקסילן שוב. מלא את מחזיק השקופית באתנול 100% (EtOH), וודא שכל הרקמה בשקופית שקועה לחלוטין. אפשר לשבת במשך 3 דקות. יוצקים את EtOH תוך החזקת השקופיות בזהירות. מילוי מחדש לאותה רמה עם יותר EtOH. אפשר לשבת במשך 2 דקות. שפוך שוב את ה- EtOH והסר את השקופית. בזהירות מניחים אותם עם הפנים כלפי מעלה על מגבת נייר נקייה לייבוש. אפשר לשבת במשך 10 דקות. 2. גירוד השקופיות הכן חיץ עיכול/תיזה עם 650 מ”ל של מים מטופלים diethylpyrocarbonate (DEPC), 100 מ”ל של חומצה אתילנדיאמינטית טראצטית (EDTA), 50 מ”ל של טריס הידרוכלוריד (טריס-HCL) 2 m pH 8.8, ו 200 מ”ל של 10% נתרן דודציל סולפט (SDS) (ראה טבלת חומרים). מלא צינור פוליפרופילן חד-שלבי של 1.5 מ”ל עם חיץ 80 μL של עיכול/תזה (ראה רשימת חומרים). שים טיפ פיפטה נקי לתוך המאגר. זהה רקמות סרטן של אזור הגידול המתאים ביותר עבור macrodissection על פי החלק המוכתם H&E המתאים.הערה: אזור הגידול עבור macrodissection צריך להיות מזוהה על ידי רצוי שני פתולוגים מוסמכים. רקמת סרטן Macrodissect מבוסס על סעיף מוכתם H&E מסומן. קח סכין גילוח נקי בעדינות לגרד את רקמת הסרטן את השקופית, מנסה לשמור אותו בחתיכה אחת, כך קל יותר לעבוד עם. קח את קצה פיפטה מתוך צינור פוליפרופילן חד-שימוש המכיל חיץ ולהשתמש בו כדי להעביר את הרקמה גרוטאות לתוך בקבוקון החיץ (ראה רשימת חומרים).הערה: הקצה הרטוב צריך למשוך את הרקמה, מה שהופך את ההעברה לקלה יותר. חזור על שלב 2.5 עם שאר השקופיות. אחרי כל הרקמה היא בצינור פוליפרופילן חד שימוש, להשתמש בקצה כדי לוודא את הרקמה שקועה לחלוטין והוא לא דבוק לקיר של הצינור. הוסף 20 μL של פרוטאז סרין הקשורות subtilisin לבקבוקון בעדינות תנועה לערבב (ראה רשימת חומרים). מניחים את הבקבוקון בבלוק חום של 55 מעלות צלזיוס לפחות 4 שעות או לילה. הקפד מעט מערבולת לאחר 2 שעות. 3. טיפול ביסולפי השתמש 45 μL של פתרון רקמה מתעכל כמו המדגם. בצע את הטיפול הביסולפי באמצעות רייגנטים בערכת המרה ביסולפית בהתאם להוראות היצרן (ראה רשימת חומרים). הוסף 5 μL של מאגר דילול לדגימה DNA דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 15 דקות (ראה רשימת חומרים). בעוד הדגימות דגירה, להכין את reagent המרה bisulfite על ידי הוספת 750 μL של dH2O ו 210 μL של מאגר דילול לצינור אחד של REAGENT המרת CT (ראה רשימת חומרים). מערבבים את הצינורות על ידי מערבולת במשך 10 דקות. לאחר הדגירה של 15 דקות, להוסיף 100 μL של reagent המרת CT מוכן לכל מדגם ומערבבים על ידי היפוך. הדגירה את הדגימות בחושך ב 50 °C (60 °F) במשך 12 עד 16 שעות. לאחר הדגירה, להסיר את הדגימות ואת המקום על הקרח במשך 10 דקות. הוסף 400 μL של מאגר איגוד ומערבבים כל מדגם על ידי צינור למעלה ולמטה (ראה רשימת חומרים). טען כל דגימה לתוך עמודת ספין והצב את העמודה בצינור איסוף של 2 מ”ל (ראה רשימת חומרים). צנטריפוגה כל מדגם במלוא המהירות (10,000 x g)במשך דקה אחת ולזרוק את הזרימה דרך. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף לכל עמודה ולסובב במלוא המהירות במשך 1 דקות, השלכת זרימה דרך (ראה רשימת חומרים). הוסף 200 μL של מאגר desulfonation לכל עמודה ולאפשר לעמוד בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות (ראה רשימת חומרים). לאחר הדגירה, לסובב את העמודים במלוא המהירות במשך 1 דקה ולהשליך את הזרימה דרך. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף לכל עמודה ולסובב במלוא המהירות במשך 1 דקות (ראה רשימת חומרים). חזור על שלב זה פעם נוספת. הוסף 46 μL של dH2O לכל עמודה והצב כל עמודה בצינור פוליפרופילן סטרילי חדש של 1.5 מ”ל לשימוש יחיד (ראה רשימת חומרים). סובב כל צינור במשך 2 דקות כדי לחמק מהדנ”א. הסר כל עמוד ספין מצינור פוליפרופילן חד-שימושי והשליך (ראה רשימת חומרים). הדנ”א מוכן כעת לניתוח. 4. פלטפורמת מערך להערכת מתילציה של DNA בלוקוס CpG בגנום האנושי להעריך את איכות ה-DNA (בדיקת איכות: QC) באמצעות FFPE QC בדיקה על מכשיר הגברה וזיהוי PCR בזמן אמת, עם ניתוח נתונים הבאים שבוצעו על פי הוראות היצרנים (ראה רשימת חומרים).הערה: דגימות עם ∆Cq פחות מה- 5.0 המומלץ מעובדותעוד יותר 14. לנתח דגימות עם פלטפורמת מערך להערכה מורכבת של מתילציה DNA כדי להעריך את מצב מתילציה של >450,000 אתרי CpG בגנום (ראה רשימת חומרים). גיליון פרטי מוצר, גליון נתונים וקבצי מוצר עבור פלטפורמת המערך זמינים15.הערה: ההתבצעות מתבצעת בהתאם להוראות היצרן עבור חומר FFPE14. חשב מתילציה גבוהה ונמוכה של לוקוס בכלי ניתוח נתונים עבור פלטפורמת מערך כערך β, עם טווח שאורכו בין 0 ל- 1, בהתאמה (ראה רשימת חומרים). השתמש בתוכנה מסחרית זמינה (ראה רשימת חומרים)כדי לחשב β ערך מסחרי. יבא נתונים שנוצרו בפלטפורמת המערך להערכה מורכבת של פלטפורמת מתילציה של DNA לסביבת התוכנה R (R v.2.15.1) ועבד אותם באמצעות כלי לניתוח מערכימתילציה 16,17.הערה: במפת החום, הנוצרת באמצעות כלי לניתוח נתונים, עמודות מסודרות על-ידי קיבוץ באשכולות ללא השגחה, בעוד שסדר השורות מבוסס על המשמעות ההולכת ופוחתת של סטטיסטיקת t עבור מתילציה דיפרנציאלית מלמעלה למטה. חלק את מפת החום לקבוצות מתילציה גבוהות ונמוכה באמצעות המפריד הראשון באשכולות ללא השגחה.הערה: עבור אימות עם PCR (qMSP) ספציפי מתילציה כמותית, בחר גנים המבוססים על ערך β גדול יותר ביחס לאיי CpG באזור האמרגן, ובשל התאמתם לעיצוב פריימר ובדיקה עבור qMSP. 5. PCR כמותי ספציפי לתיעוב (qMSP) השתמש בדנ”א שעבר שינוי ביסולפית מהשלב 3.3 כתבנית עבור PCR מבוסס פלואורסצנטיות בזמן אמת ב- qMSP כדי להעריך מתילציה של אזור האמרגן בכל ניתוח גנים. בצע qMSP באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת 96 היטב (ראה רשימת חומרים). בדוק את מצב מתילציה האמרגן של גן היעד על ה-DNA שונה ביסולפיט באמצעות פריימר קדימה 200 ננומטר, 200 nM פריימר הפוך, ו 80 nM בדיקות. הכן את תערובת האב עם 16.6 מ”מ (NH4)2SO4, 67 mM טריס pH 8.8, 10 מ”מ β-mercaptoethanol, 10 nM פלואורסצין, 0.166 מ”מ של כל דלוקסינוקלאוטיד טריפוספט, ו 0.04 U/ μl של פולימראז DNA (ראה רשימת חומרים). נפח התגובה הסופי בכל באר לכל הראיה הוא 25 μL. בצע רכיבה על אופניים של qMSP כדלקמן: 95 °C (60 °F) במשך 5 דקות, ואחריו 55 מחזורים של 95 °C (60 °F) עבור 15 s, 60 °C (60 °F) במשך 1 דקות, ו 72 °C (72 °F) במשך 1 דקות.הערה: יש לבחור גן יעד על סמך הקריטריונים של ערכי בטא גדולים יותר, להיות קשור לאיי CpG באזור האמרגן, ולהיות מתאים לעיצוב פריימר ובדיקה עבור qMSP. השתמש בגנים אנושיים שטופלו במתילאז CpG (M.SssI) כבקרת מתילציה חיובית (ראה רשימת חומרים).הערה: הכימות הסופי של מתילציה מוגדר כערך המתילציה היחסי (RMV), ומחושב כ- 2-ΔΔCt עבור כל שכפול זיהוי מתילציה בהשוואה ל- Ct הממוצע עבור β-Actin (ACTB)18. רצפי פריימר ובדיקה מוצגים בטבלה 1. Ct של 100 משמש עבור שכפולים שלא זוהו, המעניקים ערך של 2–ΔΔCt קרוב לאפס. הנוסחה הבאה משמשת: ממוצע 2–ΔΔCt (RMV) = (2–2 Ct_replicate_1 +2 –2 Ct_replicate_2 + 2–Ct_replicate_3)/318.