Genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag- en darmkanker

Alle gevolgde procedures waren in overeenstemming met de ethische normen van de ethische commissie van de instellingen voor menselijk onderzoek. De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het Juntendo University Shizuoka Hospital, en schriftelijke geïnformeerde toestemming werd kwijtgescholden vanwege het retrospectieve ontwerp. 1. Het wassen van de glijbanen Bereid 10 μm van niet-gekleurde formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) secties voor. Plaats dia’s in een glazen schuifhouder: gebruik ongeveer 3-5 grootste dwarsdoorsnededia’s, tenzij het weefsel minimaal is en er meer glijbanen nodig zijn. Vul de schuifhouder met xyleen en zorg ervoor dat al het weefsel op de glijbaan onder water staat. Laat 15 minuten zitten. Giet na 15 minuten de xyleen uit met de glijbanen met een pipettepunt, zodat de glijbanen er niet uitvallen. Giet in meer xyleen op hetzelfde niveau als voorheen. Laat nog 15 minuten zitten. Na 15 minuten, giet de xyleen weer. Vul de schuifhouder met 100% ethanol (EtOH) en zorg ervoor dat al het weefsel op de glijbaan volledig onder water staat. Laat 3 minuten zitten. Giet de EtOH af terwijl u de glijbanen zorgvuldig vasthoudt. Bijvullen op hetzelfde niveau met meer EtOH. Laat 2 minuten zitten. Giet de EtOH opnieuw af en verwijder de dia. Plaats ze voorzichtig naar boven op een schone papieren handdoek te drogen. Laat 10 minuten zitten. 2. Schrapen van de dia’s Bereid de digestie/lysebuffer voor met 650 mL diethylpyrocarbonaat (DEPC)-behandeld water, 100 mL ethyleenediaminetetraacetisch zuur (EDTA), 50 ml Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 en 200 mL van 10% natrium dodecylsulfaat (SDS) (zie tabel met materialen). Vul een polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik van 1,5 mL met 80 μL digestie/lysisbuffer (zie tabel met materialen). Doe een schone pipetpunt in de buffer. Identificeer kankerweefsels van het tumorgebied dat het meest geschikt is voor macrodissection volgens de juiste H&E-gekleurde sectie.OPMERKING: Het tumorgebied voor macrodissection moet worden geïdentificeerd door bij voorkeur twee gekwalificeerde pathologen. Macrodissect kankerweefsel op basis van de gemarkeerde H & E gekleurde sectie. Neem een schoon scheermesje en schraap voorzichtig het kankerweefsel van de glijbaan, in een poging om het te houden in een stuk, zodat het gemakkelijker is om mee te werken. Neem de pipetpunt uit polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik met buffer en gebruik deze om het afgedankte weefsel over te brengen in de bufferbak (zie Tabel van materialen).LET OP: De natte tip moet het weefsel aantrekken, wat de overdracht gemakkelijker maakt. Herhaal stap 2.5 met de rest van de dia’s. Na al het weefsel is in eenmalig gebruik polypropyleen buis, gebruik maken van de tip om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig ondergedompeld en is niet vast aan de wand van de buis. Voeg 20 μL van een subtilisine-gerelateerde serine protease toe aan de flacon en veeg voorzichtig om te mengen (zie Tabel van Materialen). Plaats de flacon minstens 4 uur of ‘s nachts in een 55 °C-warmteblok. Zorg ervoor dat u iets vortex na 2 uur. 3. Behandeling met bisulfie Gebruik 45 μL van de verteerde weefseloplossing als monster. Voer de bisulfitebehandeling uit met reagentia in een bisulfite conversiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Tabel met materialen). Voeg 5 μL verdunningsbuffer toe aan het DNA-monster en broed gedurende 15 minuten bij 37 °C (zie tabel met materialen). Terwijl de monsters uitbroeden, bereidt u het bisulfiteconversiereagereagerensagemiddel voor door 750 μL dH2O en 210 μL verdunningsbuffer toe te voegen aan één buis CT-omzettingsreagensage (zie tabel met materialen). Meng de buizen door vortexing voor 10 min. Voeg na de incubatie van 15 minuten 100 μL van het voorbereide CT-conversiereagemiddel toe aan elk monster en meng door inversie. Broed de monsters in het donker in het donker bij 50 °C gedurende 12 tot 16 uur. Verwijder na de incubatie de monsters en leg 10 minuten op ijs. Voeg 400 μL bindende buffer toe en meng elk monster door op en neer te pipetten (zie tabel met materialen). Laad elk monster in een draaikolom en plaats de kolom in een verzamelbuis van 2 mL (zie tabel met materialen). Centrifugeren elk monster op volle snelheid (10.000 x g)gedurende 1 min en gooi de doorstroom weg. Voeg 200 μL wasbuffer toe aan elke kolom en draai gedurende 1 min op volle snelheid en gooi de doorstroom weg (zie Tabel met materialen). Voeg 200 μL desulfonatiebuffer toe aan elke kolom en laat de kolom 15 min op kamertemperatuur staan (zie Tabel met materialen). Na de incubatie draait u de kolommen gedurende 1 min op volle snelheid en gooi de doorstroom weg. Voeg 200 μL wasbuffer toe aan elke kolom en draai 1 min op volle snelheid (zie tabel met materialen). Herhaal deze stap nog een keer. Voeg 46 μL dH2O toe aan elke kolom en plaats elke kolom in een nieuwe steriele 1,5 mL polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik (zie tabel met materialen). Draai elke buis 2 minuten om het DNA te ontwijken. Verwijder elke draaikolom uit de polypropyleenbuis voor eenmalig gebruik en gooi deze weg (zie tabel met materialen). Het DNA is nu klaar voor de analyse. 4. Array platform voor de evaluatie van DNA-methylatie op een CpG locus in het menselijk genoom Beoordeel de kwaliteit van DNA (kwaliteitscontrole: QC) met behulp van FFPE QC-test op een real-time PCR-versterkings- en detectie-instrument, met latere gegevensanalyse uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikanten (zie Tabel van materialen).LET OP: Monsters met ∆Cq-waarden lager dan de aanbevolen 5.0 worden verder verwerkt14. Analyseer monsters met een arrayplatform voor complexe evaluatie van DNA-methylatie om de methylatiestatus van >450.000 CpG-sites in het genoom te beoordelen (zie Tabel van materialen). Productinformatieblad, gegevensblad en productbestanden voor het arrayplatform zijnbeschikbaar 15.OPMERKING: De test wordt uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant voor FFPE-materiaal14. Bereken hoge en lage locusmethylatie in een data-analysetool voor een arrayplatform als β-waarde, met een bereik van respectievelijk 0 tot 1 (zie Tabel met materialen). Gebruik commercieel beschikbare software (zie Tabel van materialen)om een β-waarde te berekenen. Importeer gegevens die op het arrayplatform worden gegenereerd voor complexe evaluatie van DNA-methylatieplatform in de R-softwareomgeving (R v.2.15.1) en verwerk ze met behulp van een tool voor het analyseren van methylatiearrays16,17.OPMERKING: Op de heatmap, die wordt gegenereerd met behulp van een data-analyse tool, kolommen worden besteld door onbewaakte clustering, terwijl de volgorde van rijen is gebaseerd op de afnemende betekenis van de t-statistiek voor differentiële methylatie van boven naar beneden. Verdeel de heatmap in hoge en lage methylatiegroepen met behulp van de eerste differentiator in de onbewaakte clustering.OPMERKING: Voor validatie met kwantitatieve methylatie-specifieke PCR (qMSP), kies genen op basis van een grotere β-waarde in relatie tot CpG-eilanden in de promotor regio, en vanwege hun geschiktheid voor primer en sonde ontwerp voor qMSP. 5. Kwantitatieve methylatie-specifieke PCR (qMSP) Gebruik het bisulfie-gemodificeerde DNA van stap 3.3 als sjabloon voor op fluorescentie gebaseerde real-time PCR in qMSP om methylatie van het promotorgebied in elke genanalyse te evalueren. Voer qMSP uit met behulp van een 96-goed Real-Time PCR-instrument (zie tabel met materialen). Controleer op de promotor methylatie status van het doelgen op de bisulfite-gemodificeerde DNA met behulp van 200 nM forward primer, 200 nM reverse primer, en 80 nM sondes. Bereid de mastermix voor met 16,6 mM (NH4)2SO4, 67 mM Tris pH 8.8, 10 mM β-mercaptoethanol, 10 nM fluoresceïne, 0,166 mM van elk deoxynucleotide struikelfosfaat en 0,04 U/μl DNA-polymerase (zie tabel met materialen). Het uiteindelijke reactievolume in elke put voor alle tests is 25 μL. Het fietsen van qMSP als volgt uitvoeren: 95 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door 55 cycli van 95 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 1 min en 72 °C gedurende 1 min.OPMERKING: Doelgen moet worden gekozen op basis van de criteria van het hebben van grotere bètawaarden, die gerelateerd zijn aan CpG-eilanden in het promotorgebied en geschikt zijn voor primer- en sondeontwerp voor qMSP. Gebruik Human genomic behandeld met CpG Methylase (M.SssI) als een positieve methylatie controle (zie Tabel van materialen).OPMERKING: De uiteindelijke kwantificering van methylatie wordt gedefinieerd als de relatieve methylatiewaarde (RMV) en berekend als 2–ΔΔCt voor elke methylatiedetectiereplicatie in vergelijking met de gemiddelde Ct voor β-Actin (ACTB)18. Primer- en sondesequenties worden weergegeven in tabel 1. Een Ct van 100 wordt gebruikt voor onopgemerkte replicaties, wat een waarde van 2–ΔΔCt dicht bij nul geeft. De volgende formule wordt gebruikt: gemiddelde 2–ΔΔCt (RMV) = (2–ΔΔ Ct_replicate_1 + 2–ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318.