Aquí, describimos un procedimiento para el análisis del genoma de la metilación del ADN en cánceres gastrointestinales. El procedimiento es relevante para los estudios que investigan las relaciones entre los patrones de metilación de los genes y los factores que contribuyen a la carcinogénesis en los cánceres gastrointestinales.
La metilación del ADN es un cambio epigenético importante que es biológicamente significativo y un enfoque frecuente de la investigación del cáncer. La metilación del ADN en todo el genoma es una medida útil para proporcionar un análisis preciso del estado de metilación de las neoplasias malignas gastrointestinales (GI). Dados los múltiples usos traslacionales potenciales del análisis de metilación del ADN, los médicos practicantes y otros nuevos estudios de metilación del ADN deben ser capaces de entender paso a paso cómo se realizan estos análisis de todo el genoma. El objetivo de este protocolo es proporcionar una descripción detallada de cómo se utiliza este método para la identificación del biomarcador en neoplasias malignas gastrointestinales. Es importante destacar que describimos tres pasos críticos que se necesitan para obtener resultados precisos durante el análisis de todo el genoma. Clara y concisa, estos tres métodos a menudo carecen y no se notan para los nuevos estudios epigenéticos. Utilizamos 48 muestras de una neoplasia maligna gastrointestinal (cáncer gástrico) para resaltar prácticamente cómo se puede realizar un análisis de metilación del ADN en todo el genoma para las neoplasias malignas gastrointestinales.
La epigenética se refiere a cambios hereditarios en la función génica sin alteración de la secuencia del ADN1. Tales cambios pueden deberse a la metilación del ADN, en la que los grupos metilo en una base de ADN pueden alterar la expresión génica a través de cambios en el empaque de cromatina. El desarrollo y la progresión del cáncer pueden ocurrir si este efecto da lugar a una expresión alterada de los genes supresores de tumores2. El envejecimiento y la inflamación crónica son las causas del cáncer y las principales razones de los cambios en la metilación del ADN en los seres humanos3,4,5. En consecuencia, esto permite la utilización de la metilación del ADN como biomarcador en el diagnóstico del cáncer, y como objetivo para el tratamiento y la prevención. Para la detección temprana y el pronóstico del cáncer, la metilación del ADN se está midiendo en muestras de tumores, sangre, orina y heces6, mientras que los agentes desmetiladores se utilizan ahora para tratar leucemias como el síndrome mielodisplásico7.
El análisis de metilación del ADN en todo el genoma utilizando una plataforma de matriz para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus CpG individual en el genoma humano se puede utilizar para examinar el estado de metilación de más de 450.000 sitios CpG en el ADN genómico8,9, que permite la exploración de la epigenética del cáncer (ver Tabla de Materiales). Las tecnologías de secuenciación de bisulfito del genoma completo (WGBS) han cambiado nuestros enfoques en el campo de la epigenética10,11. Sin embargo, hay algunas desventajas para las tecnologías en términos de un costo sustancial y tiempo de procesamiento para el análisis epigenético de un gran número de muestras10,11. Por lo tanto, la plataforma de matriz es más factible para la evaluación compleja de la metilación del ADN en el genoma humano. La disponibilidad de enfoques para los análisis de metilación en todo el genoma ha mejorado en los últimos años y nos permite ampliar nuestro conocimiento de cómo la metilación del ADN contribuye al desarrollo y progresión del cáncer12. Los avances recientes en los enfoques de la plataforma de microarray nos proporcionan la razón para el análisis de metilación en todo el genoma para identificar una nueva firma epigenética en cánceres gastrointestinales13. El objetivo de este protocolo es proporcionar una descripción detallada de cómo se utiliza este método para la identificación de biomarcadores en neoplasias malignas gastrointestinales.
Hay tres pasos críticos para obtener resultados precisos del análisis de metoma de metilación en todo el genoma. La primera es la macrodisección de un área tumoral por preferentemente dos patólogos calificados basados en secciones representativas de H&E manchadas. La macrodisección inexacta puede causar contaminación con tejidos no cancerosos adyacentes, lo que genera resultados poco fiables; por lo tanto, se requiere una macrodisección cuidadosa. La segunda es la evaluación de la calidad del ADN (comprobación de calidad: QC). Las muestras que fallan el QC (∆Cq > 5.0) pueden dar datos de mala calidad. Por lo tanto, las muestras con ∆Cq > 5.0 deben eliminarse y otras utilizadas. El tercer paso es el cálculo del valor β, que se determina mediante una herramienta de análisis de datos para el software de plataforma de matriz como la señal metilada / la señal total (metilada + sin metilo)17. El valor β oscila entre 0-1 (o 0%-100%), que es fácil de interpretar biológicamente17. El principal problema con este valor son sus malas propiedades estadísticas, ya que su alta heteroscedasticidad implica que la varianza entre las muestras en los extremos del rango de metilación (β 0 o β 1) es altamente reducida17. Además, debido a la mala calidad de la muestra, los valores de β pueden no mostrar picos bifásicos reproducibles22,y las muestras sin tales picos deben excluirse del estudio posterior. Además, el gen objetivo debe elegirse en función de los criterios de tener valores beta más grandes, estar relacionado con las islas CpG en la región promotora y ser adecuado para el diseño de imprimación y sonda para qMSP.
La evaluación de la metilación del ADN en un locus de CpG en el genoma humano se realiza utilizando tecnología basada en microarray con un número fijo de sondas para examinar loci genómicos específicos. Es el método más utilizado en estudios de asociación de epigenome en todo el epigenomo (EWAS) debido a su bajo costo, pequeña cantidad de ADN requerido, y notablemente más corto tiempo de procesamiento de muestras, lo que permite un procesamiento de alto rendimiento de muchas muestras clínicas23. Sin embargo, una plataforma de arreglos para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus CpG individual está limitada por el número y la especificidad de las sondas para loci alterados epigenéticamente, lo que impide la exploración de algunas regiones genómicas. WGBS es generalmente visto como el método estándar de oro debido a su espectro más amplio de cobertura genómica10,11. Sin embargo, este método tiene un costo sustancial y un tiempo de procesamiento relativamente largo para el análisis de un gran número de muestras10,11. Por lo tanto, no siempre es factible. En comparación, la plataforma de arreglos para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus CpG individual en el genoma humano es razonable para su uso en términos de costo y cobertura genómica. Recientemente, las últimas fichas de cuentas mejoradas se han listo para usar24. Estos ensayos pueden ayudarnos a analizar sitios de CpG medidos casi duplicados, lo que puede lograr un estudio de asociación ideal para todo el genoma (GWAS, por sus”) para grandes poblaciones de muestras.
En resumen, el análisis del genoma de la metilación del ADN con la plataforma array para la evaluación compleja de la metilación del ADN en un locus de CpG individual en el genoma humano puede proporcionar información importante sobre los biomarcadores epigenéticos en el cáncer gastrointestinal. En comparación con WGBS, este método es rentable y reduce el tiempo de procesamiento de muestras. Por lo tanto, este método para la detección de metilación de ADN en un locus CpG es probable que sea ampliamente utilizado en la investigación de biomarcadores epigenéticos.
The authors have nothing to disclose.
Estamos especialmente agradecidos a todos los miembros del Departamento de Cirugía, el Centro Integral de Cáncer Sidney Kimmel de la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins por sus discusiones útiles y apoyo técnico. También agradecemos a Kristen Rodgers por su generosa orientación técnica sobre los procedimientos para el tratamiento de bisulfito y qMSP.
(NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |