Qui descriviamo una procedura per l’analisi a livello genomico della metilazione del DNA nei tumori gastrointestinali. La procedura è rilevante per studi che studiano le relazioni tra i modelli di metilazione dei geni e i fattori che contribuiscono alla carcinogenesi nei tumori gastrointestinali.
La metilazione del DNA è un importante cambiamento epigenetico che è biologicamente significativo e un punto focale frequente della ricerca sul cancro. La metilazione del DNA a livello genomico è una misura utile per fornire un’analisi accurata dello stato di metilazione delle neoplasie maligne gastrointestinali (IG). Dati i molteplici potenziali usi traslazionali dell’analisi della metilazione del DNA, i medici praticanti e altri nuovi studi di metilazione del DNA devono essere in grado di capire passo dopo passo come vengono eseguite queste analisi a livello genomico. L’obiettivo di questo protocollo è fornire una descrizione dettagliata di come questo metodo viene utilizzato per l’identificazione del biomarcatore nelle neoplasie maligne gastrointestinali. È importante sottolineare che descriviamo tre passaggi critici necessari per ottenere risultati accurati durante l’analisi a livello genomico. Scritti in modo chiaro e conciso, questi tre metodi sono spesso carenti e non evidenti per quelli nuovi agli studi epigenetici. Abbiamo utilizzato 48 campioni di malignità gastrointestinale (cancro gastrico) per evidenziare praticamente come l’analisi della metilazione del DNA a livello genomico può essere eseguita per le neoplasie maligne gastrointestinali.
L’epigenetica si riferisce a cambiamenti ereditari nella funzione genica senza alterazione della sequenza del DNA1. Tali cambiamenti possono essere dovuti alla metilazione del DNA, in cui i gruppi metili su una base di DNA possono alterare l’espressione genica attraverso cambiamenti nell’imballaggio della cromatina. Lo sviluppo e la progressione del cancro possono verificarsi se questo effetto si traduce in un’espressione alterata dei geni soppressori deltumore 2. L’invecchiamento e l’infiammazione cronica sono entrambe cause di cancro e le principali ragioni dei cambiamenti nella metilazione del DNAnell’uomo 3,4,5. Di conseguenza, ciò consente l’utilizzo della metilazione del DNA come biomarcatore nella diagnosi del cancro e come obiettivo per il trattamento e la prevenzione. Per la diagnosi precoce e la prognosi del cancro, la metilazione del DNA viene misurata nei campioni di tumore, sangue, urina e feci 6 ,mentregli agenti demetilanti vengono ora utilizzati per trattare le leucemie come la sindrome mielodisplastica7.
L’analisi della metilazione del DNA a livello genomico utilizzando una piattaforma array per la valutazione complessa della metilazione del DNA in un singolo locus CpG nel genoma umano può essere utilizzata per esaminare lo stato di metilazione di oltre 450.000 siti CpG nel DNA genomico8,9, che consente l’esplorazione dell’epigenetica del cancro (vedi Tabella dei materiali). Le tecnologie di sequenziamento della bisolfito dell’intero genoma (WGBS) hanno cambiato i nostri approcci nel campo dell’epigenetica10,11. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi per le tecnologie in termini di costi e tempi di elaborazione sostanziali per l’analisi epigenetica di un gran numerodi campioni 10,11. Pertanto, la piattaforma array è più fattibile per una valutazione complessa della metilazione del DNA nel genoma umano. La disponibilità di approcci per le analisi di metilazione a livello genomico è migliorata negli ultimi anni e ci consente di espandere la nostra conoscenza di come la metilazione del DNA contribuisca allo sviluppo e alla progressione del cancro12. I recenti progressi negli approcci a piattaforma microarray ci forniscono la logica per l’analisi della metilazione a livello genomico per identificare una nuova firma epigenetica nei tumorigastrointestinali 13. L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire una descrizione dettagliata di come questo metodo viene utilizzato per l’identificazione del biomarcatore nelle neoplasie di ig.
Ci sono tre fasi critiche per ottenere risultati accurati dall’analisi a livello genomico della metilazione del DNA. Il primo è la macrodisezione di un’area tumorale da parte di due patologi qualificati basati su sezioni colorate H&E rappresentative. La macrodisezione imprecisa può causare contaminazione con tessuti non cancerosi adiacenti, il che genera risultati inaffidabili; pertanto, è necessaria un’attenta macrodisezione. Il secondo è la valutazione della qualità del DNA (controllo di qualità: QC). I campioni che non riescono il QC (∆Cq > 5.0) possono fornire dati di scarsa qualità. Pertanto, i campioni con ∆Cq > 5.0 devono essere rimossi e altri utilizzati. Il terzo passo è il calcolo del valore di β, che è determinato da uno strumento di analisi dei dati per il software della piattaforma array come segnale metilato / il segnale totale (metilato + non metilato)17. Il β-valore varia da 0 a 1 (o 0%–100%), che è semplice da interpretare biologicamente17. Il problema principale di questo valore sono le sue scarse proprietà statistiche, poiché la sua elevata eterogeneità implica che la varianza tra i campioni agli estremi dell’intervallo di metilazione (β = 0 o β = 1) èaltamente ridotta 17. Inoltre, a causa della scarsa qualità del campione, i valori di β potrebbero non mostrare picchi bifasici riproducibili22e i campioni senza tali picchi dovrebbero essere esclusi da ulteriori studi. Inoltre, il gene bersaglio dovrebbe essere scelto in base ai criteri di avere valori beta più grandi, essendo correlato alle isole CpG nella regione promotrice ed essendo adatto per la progettazione di primer e sonde per qMSP.
La valutazione della metilazione del DNA in un locus CpG nel genoma umano viene eseguita utilizzando una tecnologia basata su microarray con un numero fisso di sonde per rilevamento di loci genomici specifici. È il metodo più utilizzato negli studi di associazione a livello di epigenoma (EWAS) a causa del suo basso costo, della piccola quantità di DNA richiesta e del tempo di elaborazione del campione notevolmente più breve, che consente l’elaborazione ad alta produttività di molti campioni clinici23. Tuttavia, una piattaforma array per la valutazione complessa della metilazione del DNA in un singolo locus CpG è limitata dal numero e dalla specificità delle sonde per loci alterati epigeneticamente, che impedisce l’esplorazione di alcune regioni genomiche. Il WGBS è generalmente visto come il metodo gold standard grazie al suo più ampio spettro di coperturagenomica 10,11. Tuttavia, questo metodo ha un costo sostanziale e un tempo di elaborazione relativamente lungo per l’analisi di un gran numerodi campioni 10,11. Pertanto, non è sempre fattibile. In confronto, la piattaforma array per la valutazione complessa della metilazione del DNA in un singolo locus CpG nel genoma umano è ragionevole per l’uso in termini di costi e copertura genomica. Recentemente, gli ultimi chip di perline aggiornati si sono preparati a utilizzare24. Questi test possono aiutarci ad analizzare siti CpG misurati quasi raddoppiati, che possono ottenere uno studio di associazione ideale a livello genomico (GWAS) per grandi popolazioni campione.
In sintesi, l’analisi a livello genomico della metilazione del DNA con la piattaforma array per la valutazione complessa della metilazione del DNA in un singolo locus CpG nel genoma umano può fornire importanti informazioni sui biomarcatori epigenetici nel cancro gastrointestinale. Rispetto a WGBS, questo metodo è conveniente e riduce i tempi di elaborazione dei campioni. Pertanto, questo metodo per il rilevamento della metilazione del DNA in un locus CpG è probabile che sia ampiamente utilizzato nella ricerca sui biomarcatori epigenetici.
The authors have nothing to disclose.
Siamo particolarmente grati a tutti i membri del Dipartimento di Chirurgia, il Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center presso la Johns Hopkins University School of Medicine per utili discussioni e supporto tecnico. Ringraziamo anche Kristen Rodgers per la generosa guida tecnica sulle procedure per il trattamento bisolfito e qMSP.
(NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | 14148 | Step 5.2. |
10% Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Quality Biological | 351-032-721 EA | Step 2.1. |
100 % Ethanol | Sigma-Aldrich | 24194 | Step 1.7. |
ABI StepOnePlus Real-Time PCR System | Applied BioSystems | 4376600 | Step 5.2. 96-well Real-Time PCR instrument |
CT conversion reagent | Zymo Research | D5001-1 | Step 3.2.3. |
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) | Invitrogen | 10297-018 | Step 5.2. |
DEPC-treated water | Quality Biological | 351-068-131 | Step 2.1. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Corning | 46-034-CL | Step 2.1. |
EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5002 | Step 3.2. |
Fluorescein | Bio-Rad | #1708780 | Step 5.2. |
GenomeStudio | omicX | OMICS_00854 | Step 4.3. Data analysis tool for an array platform as a β-value, with a range from 0 to 1 |
Human genomic DNA | New England Bio Labs | N4002S | Step 5.3. |
Infinium HD FFPE QC Kit | Illumina | WG-321-1001 | Step 4.1. FFPE QC assay on a real-time PCR amplification |
Infinium HumanMethylation450 assay | Illumina | WG-314 | Step 4.2. Array platform for complex evaluation of DNA methylation to assess the methylation status of >450,000 CpG sites in the genome |
LightCycler 480 | Roche | 5015278001 | Step 4.1. |
M-Binding Buffer | Zymo Research | D5002-3 | Step 3.2.6. |
M-Desulphonation Buffer | Zymo Research | D5002-5 | Step 3.2.9. |
M-Dilution Buffer | Zymo Research | D5002-2 | Step 3.2.1. |
Minfi package | Bioconductor | N/A | Step 4.4. |
M-Wash Buffer | Zymo Research | D5002-4 | Step 3.2.10. |
Platinum Taq polymerase | ThermoFisher Scientific | 10966-034 | Step 5.2. |
Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | Step 2.8. |
Single-use polypropylene (Eppendorf) tube | Eppendorf | 24533495 | Step 2.5.2. |
Tris hydrochloride (Tris-HCL) 2 M pH 8.8 | Quality Biological | 351-092-101 | Step 2.1. |
Xylene | Sigma-Aldrich | 214736 | Step 1.3. |
Zymo Spin 1 Column | Zymo Research | C1003 | Step 3.2.6. |
β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Step 5.2. |