消化器癌におけるDNAメチル化のゲノムワイド解析

すべての手続きは、機関の人間研究倫理委員会の倫理基準に従っていました。この研究は、順天堂大学静岡病院の機関審査委員会によって承認され、遡及的な設計のために書面によるインフォームド・コンセントが放棄された。 1. スライドを洗う 10 μmの未染色ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)セクションを用意します。 スライドをガラススライドホルダに配置する:ティッシュが最小で、より多くのスライドが必要でない限り、約3-5最大の断面スライドを使用してください。 スライドホルダーにキシレンを充填し、スライド上のすべての組織が水没していることを確認します。15分間座ります。 15分後、スライドが抜けないようにピペットチップでスライドを保持したキシレンを注ぎます。 以前と同じレベルに多くのキシレンを注ぎます。さらに15分間座ります。 15分後、再びキシレンを注ぎます。 スライドホルダーに100%エタノール(EtOH)を充填し、スライド上のすべての組織が完全に水没していることを確認します。3分間座ります。 慎重にスライドを保持しながら、EtOHを注ぎます。より多くのEtOHで同じレベルにリフィルします。2分間座ります。 もう一度EtOHを注ぎ、スライドを取り外します。清潔なペーパータオルの上に慎重に顔を上げて乾かします。10分間座ります。 2. スライドを削る 650 mLのジエチルピーロカーボネート(DEPC)処理水、100 mLのエチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、50mlのトリス塩酸塩(トリスHCL)2 MpH 8.8、および200 mLのドデシルスルフェートナトリウム(SD)を用いて消化/リシスバッファーを調製する( 材料)。 1.5 mLの単回使用ポリプロピレンチューブに80 μLの消化/リシスバッファーを充填します( 材料表を参照)。 きれいなピペットチップをバッファーに入れます。 適切なH&E染色部に従ってマクロ解剖に最も適した腫瘍領域の癌組織を同定する。注:マクロ解剖のための腫瘍領域は、好ましくは2人の修飾された病理学者によって同定されるべきである。 マークされたH&E染色部に基づいて癌組織をマクロ解剖する。 きれいなカミソリの刃を取り、滑らかにスライドから癌組織を削り取り、それを一枚に保ち、作業しやすいようにします。 バッファーを含む使い捨てのポリプロピレンチューブからピペットチップを取り出し、それを使用して廃棄された組織をバッファバイアルに移します( 材料表を参照)。注:濡れた先端は、転送が容易になる組織を引き付ける必要があります。 残りのスライドでステップ 2.5 を繰り返します。 すべての組織が使い捨てのポリプロピレンチューブに入った後、ティッシュが完全に水没し、管の壁に付着していないことを確認するために先端を使用してください。 バイアルに20μLのサチリシン関連セリンプロテアーゼを加え、軽くフリックして混ぜます( 材料表を参照)。 バイアルを55°Cのヒートブロックに4時間または一晩置きます。2時間後に少し渦を作るようにしてください。 3. バイサルファイト治療 消化した組織溶液の45 μLをサンプルとして使用します。 製造者の指示に従って、バイサルファイト変換キットで試薬を使用してバイサルファイト処理を行います( 材料表を参照)。 5 μL の希釈バッファーを DNA サンプルに加え、37 °C で 15 分間インキュベートします ( 材料表を参照)。 サンプルがインキュベートしている間に、750 μLのdH2Oと210 μLの希釈バッファーをCT変換試薬の1つのチューブに加えて、バイサルファイト変換試薬を調製します( 材料表を参照)。10分間ボルテックスでチューブを混ぜます。 15分インキュベーション後、調製したCT変換試薬を100μLずつ各サンプルに加え、反転によって混合します。 50°Cの暗闇の中で12〜16時間、サンプルをインキュベートする。 インキュベーション後、サンプルを取り出し、氷の上に10分間置きます。 400 μL の結合バッファーを追加し、各サンプルを上下にピペット処理して混合します ( 資料表を参照)。各サンプルをスピンカラムにロードし、そのカラムを 2 mL コレクションチューブに配置します( 材料表を参照)。 1分間、全速速(10,000 x g)でサンプルを遠心分離し、流量を廃棄します。 各カラムに200 μLの洗浄バッファを追加し、フルスピードで1分間回転し、フロースルーを破棄します( 材料表を参照)。 各カラムに200 μLの脱サル化バッファを加え、カラムを室温で15分間放置します( 材料表を参照)。インキュベーション後、カラムを全速速度で1分間回転させ、フロースルーを廃棄します。 各カラムに200 μLの洗浄バッファーを追加し、1分間フルスピードでスピンします( 材料表を参照)。 この手順をもう一度繰り返します。 各カラムに46 μLのdH2Oを加え、各カラムを新しい滅菌1.5 mLの単独使用ポリプロピレンチューブに入れる( 材料表を参照)。DNAを溶出させるために2分間、各チューブを回転させます。 シングルユースポリプロピレンチューブから各スピンカラムを取り外し、廃棄します( 材料表を参照)。DNAは分析の準備が整いました。 ヒトゲノムにおけるCpG遺伝子座におけるDNAメチル化評価用アレイプラットフォーム リアルタイムPCR増幅および検出機器でのFFPE QCアッセイを使用したDNA(品質チェック:QC)の品質を評価し、その後のデータ分析はメーカーの指示に従って実行されます( 材料表を参照)。注意: 推奨される 5.0 より小さい∆Cq 値を持つサンプルは、さらに14. DNAメチル化の複雑な評価のために配列プラットフォームを用いてサンプルを解析し、ゲノム中の>450,000 CpGサイトのメチル化状態を評価します( 材料表を参照)。アレイ プラットフォームの製品情報シート、データシート、および製品ファイルは15.注:アッセイは、FFPE材料14のメーカーの指示に従って行われます。 配列プラットフォームのデータ分析ツールで、高位および低位の遺伝子座メチル化を、それぞれ 0 ~ 1 の範囲でβ値として計算します ( 材料表を参照)。市販のソフトウェアを使用して( 材料表を参照)、β値を計算します。 DNAメチル化プラットフォームの複雑な評価のためにアレイプラットフォーム上で生成されたデータをRソフトウェア環境(Rv.2.15.1)にインポートし、メチル化アレイ16,17を分析するためのツールを用いて処理する。注: データ分析ツールを使用して生成されるヒートマップでは、列は教師なしクラスタリングによって順序付けされますが、行の順序は、上から下への差分メチル化の t 統計量の有意度の減少に基づいています。 教師なしクラスタリングの最初の差別化器を使用して、ヒートマップを高メチル化グループと低メチル化グループに分割します。注: 定量的メチル化特異的 PCR (qMSP) を使用した検証では、プロモーター領域の CpG 島に対するβ値の大きい値に基づいて、qMSP のプライマーおよびプローブ設計に適合性があるため、遺伝子を選択します。 5. 定量的メチル化特異的 PCR (qMSP) qMSPの蛍光ベースのリアルタイムPCRのテンプレートとして、ステップ3.3のバイサルファイト修飾DNAを使用して、各遺伝子解析におけるプロモーター領域のメチル化を評価します。 96 ウェルリアルタイム PCR 装置を使用して qMSP を実行します ( 資料表を参照)。 200 nMフォワードプライマー、200 nMリバースプライマー、および80 nMプローブを用いて、バイサルファイト修飾DNA上の標的遺伝子のプロモーターメチル化状態を確認します。マスターミックスを準備し、16.6 mM (NH4)2SO4、67mM Tris pH 8.8、10 mM β-メルカプトエタノール、10 nMフルオレセイン、各デオキシヌクレオチド三リン酸の0.166 mM、および0.04 U/μlのDNAポリメラーゼ(材料表を参照)を使用してマスターミックスを準備します。すべてのアッセイの各ウェルの最終反応容積は25μLである。 qMSP のサイクリングは、95 °C で 5 分間、95 °C が 15 s、60 °C が 1 分間、72 °C が 1 分間続きます。注:標的遺伝子は、より大きなベータ値を有し、プロモーター領域のCpG島に関連し、qMSPのプライマーおよびプローブ設計に適しているという基準に基づいて選択されるべきである。 正のメチル化制御としてCpGメチル化(M.SssI)で処理されたヒトゲノムを使用してください( 材料表を参照)。注:メチル化の最終的な定量は、相対的なメチル化値(RMV)として定義され、βアクチン(ACTB)18の平均Ctと比較して、各メチル化検出複製に対して2-ΔΔCtとして計算される。プライマーとプローブ配列を表1に示します。検出されない反復には 100 の Ct が使用され、0 に近い値は 2–ΔΔCtになります。平均 2–ΔΔCt (RMV) = (2-ΔΔδ Ct_replicate_1 + 2-ΔΔ Ct_replicate_2 + 2–ΔΔ Ct_replicate_3)/318を使用します。