Открытие гематоэнцефалического барьера с помощью фокусированного ультразвука для воздействия на структуры головного мозга и оценки хемогенетической нейромодуляции

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского технологического института, где данные были первоначально получены J.O.S. 1. Дизайн и 3D-печать шлейки животных и оборудования для наведения изображений Используйте файлы с веб-сайта лаборатории Шабловского по адресу: https://www.szablowskilab.org/downloads для 3D-печати компонентов. Убедитесь, что печатный материал имеет низкую восприимчивость к МРТ, но имеет видимую для МРТ опору. Подробнее об используемых материалах см. в разделе материалы и реактивы. Учитывайте деградацию материала при многократном использовании, многократно проверяя материал и наблюдая за местами износа, которые должны быть усилены. Убедитесь, что толщина стенок с печатью составляет не менее 2 мм. Используйте высокоточные 3D-принтеры, чтобы повысить точность наведения. Противодействуйте гравитации и другим силам, чтобы избежать отклонения пластиковых компонентов, напечатанных на 3D-принтере, поддерживая компоненты по их длине и увеличивая толщину стенок, напечатанных на 3D-принтере, если наблюдается какой-либо изгиб. Учитывайте точность по нескольким осям, включая переднюю/заднюю, медиальную/латеральную, дорсальную/вентральную, а также по рысканию, тангажу и наклону. Проверьте точность наведения, выполнив FUS-BBBO и зафиксировав отклонение от заданного положения. При использовании моторизованных стереотаксических систем оцените влияние динамического движения на эластичность материала, записав процедуру наведения FUS-BBBO на видео, и исправьте любые отклонения, утолщая стенки материала, напечатанного на 3D-принтере. 2. Описание ультразвуковой системы Используйте ультразвуковую систему с восьмиэлементным кольцевым решетчатым преобразователем (диаметр = 25 мм, естественная фокусная точка = 20 мм; апертура (F) = 0,8)) и соедините корпус с головкой с дегазированным ультразвуковым гелем, нанеся гель на бритую голову мыши.ПРИМЕЧАНИЕ: Центральная частота преобразователя, использованного в предыдущем исследовании7, составляла 1,5 МГц, длительность импульса — 10 мс, а частота повторения импульсов — 1 Гц в течение 120 с. Давление калибровалось с помощью волоконно-оптического гидрофона и поддерживалось в пределах 0,36-0,45 МПа. Предположим, что акустическое затухание составляет 18% через череп21 на частоте 1,5 МГц и теменную кость. Диапазон условий, необходимых для безопасного вскрытия ГЭБ и доставки AAV, был подробно описан в другом месте 7,14,22. 3. Подготовка животных Обезболить одну мышь с помощью ингаляции изофлурана в дозе 2% с медицинским воздухом. Проверьте глубину анестезии с помощью прикосновения, чтобы убедиться в отсутствии ответа. Затем нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы, используя одноразовую стерильную ватную палочку, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение тюбика с мазью.ПРИМЕЧАНИЕ: Типичная процедура FUS-BBBO может длиться от 30 минут до 2 часов, и анестезия должна поддерживаться на протяжении всего времени. После анестезии мыши промыть чистый катетер гепаринизированным физиологическим раствором (10 ЕД/мл).ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящий катетер для мыши 25-35 г имеет иглу 30 G и трубку PE10. Затем продезинфицируйте мышиный хвост 70% этиловым тампоном. Поместите катетер хвостовой вены в боковую хвостовую вену и закрепите ее тканевым клеем. Наблюдайте за обратным током крови из хвостовой вены в катетер, чтобы подтвердить его размещение. Побрейте голову мыши, а затем используйте крем для депиляции после высыхания тканевого клея, чтобы уменьшить вероятность попадания пузырьков воздуха под ультразвуковой гель во время озвучивания. Поместите мышь в каретку для МРТ, напечатанную на 3D-принтере, установив передние зубы на прикусную планку, а головку внутрь носового конуса (рис. 1a). Введите до 10 мкл лидокаина подкожно в место контакта с притупленными ушными планками. Затем прикрепите притупленные стержни к черепу и приложите безопасное количество давления, стараясь не оказывать давление на дыхательное горло, так как оно затрудняет дыхание. Понаблюдайте за дыханием в течение 30 с, чтобы убедиться, что животное дышит свободно со скоростью 1/с. Подсоедините направляющую к ушным планкам, проверьте дыхание, как показано в шаге 3.6 (рис. 1b), и продолжайте визуально контролировать дыхание на протяжении всей процедуры каждую минуту. Частота дыхания выше 1/с является одним из признаков потери анестезии. Продолжайте контролировать реакцию щипки пальцев каждые 5 минут, когда мыши не находятся в МРТ-сканере или если частота дыхания превышает 1/с. Переместите каретку МРТ в держатель МРТ, а затем внутрь отверстия магнита.ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция аппаратного обеспечения оптимизирована для 72-миллиметровой катушки внутри 7-тонного магнитно-резонансного томографа. Получите последовательность МРТ, чтобы локализовать мышь в сканере. Выберите последовательность 3D-быстрой съемки под низким углом (FLASH), чтобы получить весь мозг, используя следующие параметры, в соответствии с конкретными инструкциями производителя прибора. Время эхо: 3,9 мс, Время повторения: 15 мс, Угол импульса возбуждения: 15°, Размер матрицы: 130 x 130 x 114, Разрешение: 350 x 200 x 200 мкм на воксель, Средние: 1, Время съемки: 3 мин 42 с Передача файлов из системы МРТ на компьютер, управляющий системой FUS. Откройте последовательность визуализации в программном обеспечении, чтобы выполнить наведение под контролем МРТ, где изображение должно появиться, как показано на рисунке 1c. 4. Наведение на цель под контролем МРТ ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании специально разработанных направляющих для нацеливания нет необходимости помещать ультразвуковой датчик в МРТ, а также нет необходимости делать разрез кожи для выполнения нацеливания путем обнуления стереотаксиса на брегма- и лямбда-линиях. Выполните следующие действия, чтобы выполнить процесс таргетинга. Поместите каретку в стереотаксический инструмент. Закрепите его на месте с помощью металлического блока с двусторонним скотчем и прижав каретку к двум опорным стойкам стереотаксического инструмента. Передайте изображения МРТ на компьютер с запущенным программным обеспечением FUS, выбрав файлы в диспетчере данных, щелкнув правой кнопкой мыши, чтобы открыть пункты меню, и выбрав «Передать немедленно». Откройте программное обеспечение FUS и загрузите изображение, нажав «Открыть последовательность» и загрузив все файлы последовательности изображений. Переформатируйте изображение по трем осям, нажав правой кнопкой мыши и «Переформатировать». Локализуйте датчик на круговой направляющей наведения (рис. 1c), щелкнув правой кнопкой мыши. В сагиттальном виде отрегулируйте вертикальное положение виртуального преобразователя с учетом толщины водяной бани и корпуса преобразователя (в данном случае – 8,2 мм вверх, рис. 1d). Укажите область (области), на которую нужно нацелиться, в планировщике траектории и запишите координаты в электронную таблицу (в данном случае – средний мозг, как показано на рисунке 1d). Наберите нужную глубину наведения (z-значение в электронной траектории (рис. 2) и запишите координаты в электронную таблицу. Нацеливайтесь на каждую из точек, нажимая «Отправить траекторию» и «Выполнить» (рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается, когда держатель для мыши помещен внутрь двигателей. Тем не менее, такое же наведение может быть достигнуто с высокой точностью на стереотаксическом инструменте. Чтобы соотнести координаты МРТ со стереотаксической рамкой, поместите установленный на заказ датчик над направляющей для наведения и перемещайте до тех пор, пока каждый из трех болтов наведения (рис. 3, элемент A) не сможет пройти через держатель датчика (рис. 3, элемент B) и направляющую наведения (рис. 3, элемент C). Убедитесь, что болты не находятся под натяжением или наклоном. Переместите датчик на 10,56 мм вперед в переднем/заднем направлении, пока он не окажется в том же месте, где на МРТ появляется центр направляющей для наведения. Определите расстояние от центра виртуального преобразователя (рис. 3a, элемент A) до целевой области (рис. 3a, элемент B) и переместите преобразователь в эти координаты с помощью стереотаксической системы координат. Приступают к приготовлению раствора для инъекций. 5. Приготовление раствора для инъекций ПРИМЕЧАНИЕ: Микропузырьковые растворы очень чувствительны к давлению. Следовательно, энергичное перемешивание или быстрое введение через тонкие иглы может схлопнуть микропузырьки и снизить эффективность раскрытия ГЭБ. Кроме того, микропузырьки легче воды и могут всплывать в верхнюю часть трубки, катетера или шприца (рис. 4), например, в автоматическом инъекторе. Настоятельно рекомендуется ресуспендировать микропузырьковый раствор непосредственно перед каждой инъекцией. Наберите 0,8 мл физиологического раствора с помощью шприца в пробирку объемом 1,5 мл. С помощью шприца добавьте 0,1 мл контрастного вещества для МРТ в ту же пробирку объемом 1,5 мл и перемешайте. Неактивированный раствор микропузырьков23,24 довести до комнатной температуры. Непосредственно перед озвучиванием активируйте микропузырьки в течение 45 секунд в устройстве активации микропузырьков. Медленно (в течение ~3 с) извлеките 0,1 мл микропузырьков с помощью туберкулинового шприца объемом 1 мл и иглы 21 г из средней глубины жидкости. Добавьте 0,08 мл микропузырьков в раствор контрастного вещества и физиологического раствора, приготовленный на этапе 5.3. Перемешивайте, постукивая рукой в течение 15 с. При конечной концентрации AAV 0,5-2 x 10 10 вирусных частиц на грамм массы тела (VP/г) вводят груз для доставки (в данном случае AAV9) через иглу30 G в катетер хвостовой вены, в случае ATAC – AAV, несущие хемогенетические рецепторы, или отрицательный контроль, например, AAV, несущие GFP под тем же промотором. Снова перемешайте микропузырьки вручную в течение 15 с, чтобы избежать всплытия (рисунок 4). Сразу после этого аспирируйте 200 мкл раствора микропузырьков через шприц без прикрепленной иглы. Отсутствие иглы уменьшит силу сдвига на микропузырьках. Переверните шприц и перемешайте, нажимая на поршень вверх и вниз. Прикрепите иглу 30 G и, все еще перевернутые, медленно выталкивайте микропузырьки до тех пор, пока на конце иглы не появятся капли. 6. Процедура озвучивания Установите параметры для озвучивания: длительность импульса 10 мс, 120 повторов через каждые секунды и давление 0,30-0,45 МПа на череп. Снимите направляющую и нанесите дегазированный ультразвуковой гель на голову мыши, следя за тем, чтобы не образовывались пузырьки. Опустите излучатель и поместите его прямо на держатель амбушюры, а затем введите координаты в стереотаксические приборы (рис. 5). Вводят раствор ААВ (0,5-2 х10, 10 ВП/г). Смешайте микропузырьки и раствор контрастного вещества для МРТ в течение 15 с и введите 80 мкл на мышь по 30 г. Немедленно примените ультразвук в течение 120 с, нажав «Отправить» и «Выполнить». Если целью является более одного участка, переместите датчик на этот участок и отрегулируйте таргетинг по глубине в соответствии с цифрами в электронной таблице из шагов 4.7–4.9. Затем повторите шаги 6.5-6.6 для каждого инсонированного участка. 7. МРТ-оценка вскрытия ГЭБ ПРИМЕЧАНИЕ: МРТ-оценка вскрытия ГЭБ была подробно описана в другом месте11. Расположение вскрытия ГЭБ может быть визуализировано в виде более светлых участков у мышей, получивших инъекцию Т1-взвешенного Gd-контрастного вещества. После проведения ультразвукового исследования запишите последовательность МРТ, как показано в шаге 3.10. Извлеките мышь из МРТ-сканера и поместите ее в клетку для восстановления, чтобы можно было восстановиться после анестезии. Ежедневно наблюдайте за мышами на предмет признаков дистресса, потери веса или других гуманных конечных точек. Проконсультируйтесь с ветеринарным персоналом и рекомендациями IACUC, чтобы приступить к любому лечению в случае возникновения непредвиденных нежелательных явлений. 8. Стимуляция DREADD хемогенетическим лигандом Выберите хемогенетический рецептор. Для DREADD выберите рецептор hM3Dq для активации нейронов через Gq-сопряженные пути19, рецептор hM4Di для ингибирования нейрональной активности через Gi/o связанные пути20 или рецептор KORD для активации нейронов через Gs-связанные пути с использованием сальвинорин-B-лиганда25. Растворите клозапин-n-оксид (CNO) в стерильном физиологическом растворе в концентрации 1 мг/мл. Храните аликвотированный CNO при -20 °C. Вводят CNO19 или другой хемогенетический лиганд26,27,28 внутрибрюшинным путем в концентрации 0,3 – 10 мг/кг. Если необходимо зарегистрировать влияние CNO на поведение, начинайте регистрировать поведенческую активность в течение 15-45 мин после введения препарата для достижения максимальной активацииDREADDs 19. Если требуется анализ активации нейронов, используйте мышей для гистологического исследования через 60-120 минут после инъекции. Приступайте к эвтаназии через сердечную перфузию (см. раздел 9). 9. Гистологическая оценка экспрессии генов и хемогенетической активации ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как экспериментальная конечная точка (например, окончание поведенческого исследования, время, необходимое для экспрессии генов) достигнута, очень важно подтвердить местоположение и наличие экспрессии генов. После активации хемогенетическим лигандом проводят сердечную перфузию для сохранения тканей.Обезболивайте мышь смесью кетамина (100 мг/кг) / ксилазина (10 мг/кг) в стерильном физиологическом растворе через IP-инъекцию. Подтвердите анестезию зажимом пальца ноги и убедитесь, что частота дыхания снижена примерно до 1/с. Обеспечьте тепловую поддержку через грелку до подтверждения эвтаназии. Приготовьте 10% нейтральный буферный формалин (NBF) и PBS с 10 единицами гепарина на мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы должны находиться при температуре 4 °C. Разлейте каждый буфер в отдельные пробирки по 50 мл, соедините и заправьте перистальтический насос, подключенный к катетеру-бабочке 25 G, раствором PBS/гепарина. Прикрепите конечности к впитывающей синей подушечке с помощью ленты и убедитесь, что животное находится в положении лежа на подушечке. Продезинфицируйте шерсть, чтобы избежать перекрестного загрязнения периферических органов в случае необходимости их сбора. Вскрыть полость брюшины поперечным разрезом, обнажив диафрагму. Вскрыть грудную клетку через два надреза хирургическими ножницами по передней/задней оси. Обнажите сердце, поместите иглу в левую камеру (правая сторона сердца, если смотреть на лежа на спине) и поместите в катетер-бабочку на шаге 9.1.3. Сделайте небольшой разрез в правом желудочке, чтобы обеспечить отток крови. Включите перистальтическую помпу, чтобы начать промывание крови PBS/гепарином.ПРИМЕЧАНИЕ: Если этот этап не будет выполнен должным образом, кровь свернется во время фиксации формалином и препятствует надлежащей перфузии. После того, как вся кровь будет вымыта и из правого желудочка начнет выходить прозрачный PBS, переключите входное отверстие перистальтического насоса на раствор NBF и начните перфузию в дозе 25 мл на мышь. Извлеките мозг, поместите не менее 4 мл NBF и зафиксируйте на 24 часа. Срез головного мозга с помощью корональных срезов на вибратоме толщиной 50 мкм. Поместите каждую секцию в лунку с 24-луночной пластиной, хранящей срезы по всему мозгу. Оцените экспрессию хемогенетических рецепторов, слитых с флуоресцентными белками (например, mCherry или mCitrine), под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить участки, показывающие экспрессию, чтобы подтвердить местоположение. Выражение лица, скорее всего, будет тусклым. Проводят иммуноокрашивание против флуорофора по следующему протоколу:Помещают 3 среза в 0,5 мл раствора, содержащего 10% сыворотку хозяина вторичного антитела, и инкубируют в течение 30 мин. Перенесите срезы в раствор первичного антитела в разведении 1:250 – 1:1000, используя 1:500 в качестве отправной точки. Инкубируют срезы с первичными антителами в течение ночи при 4 °C в микропланшете, запечатанном парафиновой пленкой. Промойте срезы PBS 3 раза по 5 минут за раз. Добавить 0,5 мл на лунку раствора вторичных антител в 10% сыворотке. Выдерживают 4 ч при комнатной температуре. Промойте срезы PBS 3 раза по 5 минут за раз. Устанавливайте на предметные стекла с помощью водной монтажной среды, содержащей ядерное пятно (например, DAPI). Оцените локализацию и распространение с помощью конфокального микроскопа, выполнив сканирование плитки всего среза. Оцените интенсивность экспрессии, измерив интенсивность пикселей флуоресценции в целевых областях мозга и сравните с контролем с внутричерепной инъекцией. В качестве альтернативы можно оценить процент положительных нейронов путем подсчета клеток, окрашенных против хемогенетических рецепторов, по сравнению с DAPI-положительными клетками или клеточно-специфическими маркерами. Оцените повреждение тканей, выполнив окрашивание гематоксилином на срезе 50 мкм и визуализируя потерю клеток, накопление клеточного мусора и другие признаки грубого повреждения. Чтобы оценить специфичность клеточного таргетирования, проводят двойное иммуноокрашивание, как описано ниже, для хемогенетического рецептора и клеточно-специфического маркера. Затем выполните подсчет положительных ячеек, как показано на шаге 9.8.Помещают 3 среза в 0,5 мл раствора, содержащего 10% сыворотку хозяина вторичного антитела, и инкубируют в течение 30 мин. Переносят срезы в раствор первичного антитела против флуоресцентного маркера хемогенетического рецептора в разведении 1:250 – 1:1,000, используя 1:500 в качестве отправной точки. Добавьте второе первичное антитело от другого вида хозяина, которое нацелено на интересующий клеточный маркер (например, CamkIIa). Инкубируют срезы с первичными антителами в течение ночи при 4 °C в микропланшете, запечатанном парафиновой пленкой. Промойте срезы PBS 3 раза по 5 минут за раз. Добавляют 0,5 мл раствора вторичных антител на лунку в 10% сыворотке крови от вида хозяина обоих вторичных антител.ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое антитело должно иметь отдельный флуорофор и должно быть реактивным против первичных антител на этапе 9.10.2. Выдерживают 4 ч при комнатной температуре. Промойте срезы PBS 3 раза по 5 минут за раз. Установите на салазки и зафиксируйте водной монтажной средой, содержащей ядерное пятно. 10. Оценка активации нейронов с помощью иммуноокрашивания на c-Fos Выполните окрашивание c-Fos, как указано в пункте 9.5 данного протокола, используя первичное антитело к c-Fos и вторичное антитело с флуоресцентной меткой, отличной от ядерного окрашивателя. Подсчитайте процент клеток, которые являются положительными как на c-Fos, так и на ядерное окрашивание в области, на которую нацелен хемогенетический рецептор. Проанализируйте процент c-Fos положительных ядер в группе мышей, экспрессирующих хемогетические рецепторы и обработанных хемогенетическим лигандом или контролем транспортных средств, а также в группе мышей дикого типа, получавших хемогенетический лиганд или контроль транспортных средств.