Ouverture de la barrière hémato-encéphalique induite par ultrasons focalisés pour cibler les structures cérébrales et évaluer la neuromodulation chimiogénétique

Toutes les expériences ont été menées selon un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut de technologie de Californie, où les données ont été obtenues à l’origine par J.O.S. 1. Conception et impression 3D de harnais pour animaux et de matériel de guidage d’image Utilisez les fichiers du site Web du laboratoire Szablowski à l’adresse suivante : https://www.szablowskilab.org/downloads pour l’impression 3D des composants. Assurez-vous que le matériau d’impression a une faible sensibilité à l’IRM mais qu’il a un support visible à l’IRM. Voir le détail des matériaux utilisés dans la section Matériaux et réactifs. Tenez compte de la dégradation du matériau avec de multiples utilisations en testant le matériau à plusieurs reprises et en observant les sites d’usure qui doivent être renforcés. Assurez-vous que les parois imprimées ont une épaisseur d’au moins 2 mm. Utilisez des imprimantes 3D de haute précision pour améliorer la précision du ciblage. Contrez la gravité et d’autres forces pour éviter la déviation des composants imprimés en plastique en 3D en soutenant les composants sur toute leur longueur et en augmentant l’épaisseur des parois imprimées en 3D si une flexion est observée. Tenez compte de la précision dans plusieurs axes, y compris antérieur/postérieur, médial/latéral, dorsal/ventral, ainsi que le lacet, le tangage et l’inclinaison. Testez la précision du ciblage en effectuant FUS-BBBO et en enregistrant l’écart par rapport à la position ciblée. Si vous utilisez des systèmes stéréotaxiques motorisés, évaluez les effets du mouvement dynamique sur l’élasticité du matériau en enregistrant la procédure de ciblage FUS-BBBO sur vidéo, et corrigez tout écart en épaississant les parois du matériau imprimé en 3D. 2. Description de l’échographe Utilisez un système à ultrasons avec un transducteur à réseau annulaire à huit éléments (diamètre = 25 mm, point focal naturel = 20 mm ; ouverture (F) = 0,8)) et couplez le boîtier à la tête avec du gel à ultrasons dégazé en appliquant du gel sur la tête de souris rasée.REMARQUE : La fréquence centrale d’un transducteur utilisé dans une étude antérieure7 était de 1,5 MHz, la durée de l’impulsion était de 10 ms et la fréquence de répétition de l’impulsion était de 1 Hz sur 120 s. Les pressions ont été calibrées à l’aide d’un hydrophone à fibre optique et maintenues entre 0,36 et 0,45 MPa. Supposons une atténuation acoustique de 18 % à travers le crâne21 pour 1,5 MHz et l’os pariétal. La gamme de conditions appropriées pour une ouverture de la BHE et une administration de l’AAV en toute sécurité a été décrite ailleurs en détail 7,14,22. 3. Préparation des animaux Anesthésier une souris en inhalant de l’isoflurane à 2 % avec de l’air de qualité médicale. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par un pincement tactile pour confirmer l’absence de réponse. Ensuite, appliquez une pommade ophtalmique pour prévenir le dessèchement de la cornée à l’aide d’un coton-tige stérile à usage unique pour éviter la contamination croisée du tube de pommade.REMARQUE : La procédure typique de FUS-BBBO peut durer entre 30 minutes et 2 heures, et l’anesthésie doit être maintenue tout au long de l’intervention. Une fois la souris anesthésiée, laver un cathéter propre avec une solution saline héparinée (10 U/ml).REMARQUE : Un cathéter approprié pour une souris de 25 à 35 g a une aiguille de 30 G et une tubulure PE10. Désinfectez ensuite la queue de la souris avec un tampon à 70 % d’éthanol. Placez le cathéter de la veine caudale dans une veine caudale latérale et fixez-le avec une colle à tissu. Observez un reflux de sang de la veine caudale dans le cathéter pour confirmer sa position. Rasez la tête de la souris, puis utilisez une crème d’épilation après le séchage de la colle tissulaire afin de réduire la possibilité que des bulles d’air soient piégées sous le gel ultrasonique pendant l’insonation. Placez la souris dans un chariot d’IRM imprimé en 3D, en montant les dents de devant sur une barre d’occlusion et la tête à l’intérieur d’un cône de nez (Figure 1a). Injecter jusqu’à 10 μL de lidocaïne par voie sous-cutanée à l’endroit où les embouts sont émoussés. Ensuite, fixez les barres émoussées au crâne et appliquez des quantités sûres de pression, en prenant soin de ne pas appliquer de pression sur la trachée car elle entrave la respiration. Observez la respiration pendant 30 s pour confirmer que l’animal respire librement à un rythme de 1/s. Connectez le guide de ciblage aux barres auriculaires, vérifiez la respiration comme à l’étape 3.6 (Figure 1b) et continuez à surveiller visuellement la respiration tout au long de la procédure toutes les minutes. Une fréquence respiratoire élevée au-dessus de 1/s est l’une des indications d’une perte d’anesthésie. Continuez à surveiller la réponse de pincement des orteils toutes les 5 minutes lorsque les souris ne sont pas dans le scanner IRM ou si la fréquence respiratoire est élevée au-dessus de 1/s. Transférez le chariot d’IRM dans un support d’IRM, puis à l’intérieur de l’alésage d’un aimant.REMARQUE : La conception du matériel est optimisée pour une bobine de 72 mm à l’intérieur d’une IRM 7T. Procurez-vous une séquence d’IRM pour localiser la souris dans le scanner. Sélectionnez la séquence de prise de vue 3D rapide en contre-plongée (FLASH) pour acquérir l’intégralité du cerveau, en utilisant les paramètres suivants, selon les instructions spécifiques du fabricant de l’instrument. Temps d’écho : 3,9 ms, Temps de répétition : 15 ms, Angle d’impulsion d’excitation : 15°, Taille de la matrice : 130 x 130 x 114, Résolution : 350 x 200 x 200 μm par voxel, Moyennes : 1, Temps d’acquisition : 3 min 42s Transférez les fichiers du système d’IRM vers un ordinateur contrôlant le système FUS. Ouvrez la séquence d’imagerie dans le logiciel pour effectuer un ciblage guidé par IRM, où l’image doit apparaître comme dans la Figure 1c. 4. Ciblage guidé par IRM REMARQUE : Avec l’utilisation de guides de ciblage conçus sur mesure, il n’est pas nécessaire de placer un transducteur d’ultrasons dans une IRM, ni d’inciser la peau pour effectuer un ciblage par remise à zéro stéréotaxe sur les lignes bregma et lambda. Suivez les étapes ci-dessous pour effectuer le processus de ciblage. Placez le chariot à l’intérieur d’un instrument stéréotaxique. Fixez-le en place à l’aide d’un bloc métallique muni d’un ruban adhésif double face et en appuyant le chariot contre deux poteaux de support de l’instrument stéréotaxique. Transférez des images IRM vers un ordinateur équipé d’un logiciel de guidage FUS en cours d’exécution en sélectionnant des fichiers dans le gestionnaire de données, en cliquant avec le bouton droit de la souris pour afficher les options de menu et en sélectionnant « Transférer immédiatement ». Ouvrez le logiciel de guidage FUS et chargez l’image en cliquant sur « Ouvrir la séquence » et en chargeant tous les fichiers de la séquence d’imagerie. Reformatez l’image sur trois axes en appuyant sur le bouton droit de la souris et sur ‘Reformater’. Localisez le transducteur sur le guide de ciblage circulaire (Figure 1c) en cliquant avec le bouton droit de la souris. En vue sagittale, ajustez la position verticale d’un transducteur virtuel pour tenir compte de l’épaisseur du bain-marie et du boîtier du transducteur (dans ce cas, 8,2 mm vers le haut, Figure 1d). Pointez la ou les zones à cibler dans le planificateur de trajectoire et notez les coordonnées dans une feuille de calcul (dans ce cas, le mésencéphale, comme dans la figure 1d). Composez la profondeur de ciblage souhaitée (valeur z dans la trajectoire électronique (Figure 2) et notez les coordonnées dans une feuille de calcul. Ciblez chacun des points en appuyant sur « Envoyer la trajectoire » et « Exécuter » (Figure 2).REMARQUE : Cela se fait lorsqu’un support de souris est placé à l’intérieur des moteurs. Cependant, le même ciblage peut être obtenu avec une grande précision sur un instrument stéréotaxique. Pour corréler les coordonnées d’une IRM avec le cadre stéréotaxique, placez le transducteur monté sur mesure sur un guide de ciblage et effectuez le déplacement jusqu’à ce que chacun des trois boulons de ciblage (Figure 3, élément A) puisse traverser à la fois le support de transducteur (Figure 3, élément B) et le guide de visée (Figure 3, élément C). Assurez-vous que les boulons ne sont pas sous tension ou inclinés. Décalez le transducteur de 10,56 mm vers l’avant dans le sens antérieur/postérieur jusqu’à ce qu’il soit situé au même endroit où le centre d’un guide de ciblage apparaît sur une IRM. Déterminez la distance entre le centre du transducteur virtuel (Figure 3a, élément A) et la région ciblée (Figure 3a, élément B) et déplacez le transducteur vers ces coordonnées à l’aide d’une trame stéréotaxique. Procéder à la préparation de la solution injectable. 5. Préparation de la solution injectable REMARQUE : Les solutions de microbulles sont très sensibles à la pression. Par conséquent, un mélange vigoureux ou une injection rapide à travers des aiguilles fines peut faire s’effondrer les microbulles et réduire l’efficacité de l’ouverture de la BHE. De plus, les microbulles sont plus légères que l’eau et peuvent flotter jusqu’au sommet d’un tube, d’un cathéter ou d’une seringue (figure 4), par exemple dans un injecteur automatique. Il est fortement recommandé de remettre en suspension la solution de microbulles immédiatement avant chaque injection. Prélever 0,8 mL de solution saline à l’aide d’une seringue dans un tube de 1,5 mL. À l’aide d’une seringue, ajouter 0,1 mL d’agent de contraste IRM dans le même tube de 1,5 mL et mélanger. Amener la solution de microbulles23,24 non activée à température ambiante. Juste avant l’insonation, activez les microbulles pendant 45 s dans un dispositif d’activation de microbulles. Prélever lentement (sur ~3 s) 0,1 mL de microbulles à l’aide d’une seringue à tuberculine de 1 mL et d’une aiguille de 21 G à la profondeur moyenne d’un liquide. Ajouter 0,08 mL de microbulles dans la solution de produit de contraste et de solution saline préparée à l’étape 5.3. Mélanger en tapotant avec la main pendant 15 s. La concentration finale d’AAV étant de 0,5 à 2 x10 10 particules virales par gramme de poids corporel (VP/g), injecter la cargaison pour l’administration (dans ce cas AAV9) à travers une aiguille de 30 G dans le cathéter de la veine caudale, dans le cas d’ATAC – AAV porteurs de récepteurs chimiogénétiques, ou d’un témoin négatif, tel que les AAV portant GFP sous le même promoteur. Mélangez à nouveau les microbulles à la main pendant 15 s pour éviter qu’elles ne flottent (Figure 4). Immédiatement après, aspirez 200 μL de la solution de microbulles à l’aide d’une seringue sans aiguille. L’absence d’aiguille réduira les forces de cisaillement sur les microbulles. Retournez la seringue et mélangez en appuyant sur le piston de haut en bas. Fixez l’aiguille de 30 g et, toujours à l’envers, poussez lentement les microbulles jusqu’à ce que des gouttelettes apparaissent à l’extrémité d’une aiguille. 6. Procédure d’insonation Définissez les paramètres de l’insonation : durée d’impulsion de 10 ms, 120 répétitions, toutes les s et pression de 0,30 à 0,45 MPa au niveau du crâne. Retirez le guide de ciblage et appliquez du gel à ultrasons dégazé sur la tête de la souris, en veillant à ne pas former de bulles. Abaissez le transducteur et placez-le directement sur le support de la barre d’oreille à plat, puis composez les coordonnées dans les instruments stéréotaxiques (Figure 5). Injecter la solution d’AAV (0,5-2 x10 10 VP/g). Mélanger les microbulles et la solution de produit de contraste pour IRM pendant 15 s et injecter 80 μL par souris de 30 g. Appliquez immédiatement l’échographie pendant 120 s en appuyant sur ‘Envoyer’ et ‘Exécuter’. Si plusieurs sites sont ciblés, déplacez la sonde vers ce site et ajustez le ciblage de profondeur en suivant les nombres dans la feuille de calcul à partir des étapes 4.7 à 4.9. Répétez ensuite les étapes 6.5 à 6.6 pour chaque site sonné. 7. Évaluation par IRM de l’ouverture de la BHE NOTE : L’évaluation par IRM de l’ouverture de la BHE a été décrite en détail ailleurs11. L’emplacement de l’ouverture de la BHE peut être visualisé sous forme de zones plus lumineuses chez les souris qui ont reçu une injection d’un agent de contraste Gd pondéré en T1. Après l’application de l’échographie, enregistrez une séquence d’IRM comme à l’étape 3.10. Retirez la souris du scanner IRM et placez-la dans une cage de récupération pour permettre la récupération après l’anesthésie. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter des signes de détresse, de perte de poids ou d’autres critères d’évaluation humains. Consultez le personnel vétérinaire et les directives de l’IACUC de l’établissement pour procéder à tout traitement en cas d’événements indésirables inattendus. 8. Stimulation DREADD avec un ligand chimiogénétique Choisissez un récepteur chimiogénétique. Pour les DREADDs, choisissez le récepteur hM3Dq pour l’activation neuronale via les voies couplées Gq19, le récepteur hM4Di pour l’inhibition de l’activité neuronale via les voies couplées Gi/o20, ou le récepteur KORD pour l’activation des neurones via les voies couplées Gs à l’aide du ligand Salvinorin-B25. Dissoudre la clozapine-n-oxyde (CNO) dans une solution saline stérile à la concentration de 1 mg/mL. Conserver le CNO aliquote à -20 °C. Administrer le CNO 19, ou un autre ligand chimiogénétique26,27,28, par voie intrapéritonéale à une concentration comprise entre 0,3 et10 mg/kg. Si les effets de l’OIIO sur le comportement doivent être enregistrés, commencez à enregistrer l’activité comportementale dans les 15 à 45 minutes suivant l’administration du médicament pour obtenir l’activation maximale des DREADDs19. Si l’analyse de l’activation neuronale est souhaitée, utiliser des souris pour une évaluation histologique après 60 à 120 minutes après l’injection. Procéder à l’euthanasie par perfusion cardiaque (voir rubrique 9). 9. Évaluation histologique de l’expression des gènes et de l’activation chimiogénétique REMARQUE : Une fois que le critère d’évaluation expérimental (p. ex., fin de l’étude comportementale, temps requis pour l’expression des gènes) est atteint, il est essentiel de confirmer l’emplacement et la présence de l’expression du gène. Après activation avec un ligand chimiogénétique, effectuer une perfusion cardiaque pour préserver les tissus.Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) dans une solution saline stérile par injection intraveineuse. Confirmez l’anesthésie avec un pincement des orteils et assurez-vous que la fréquence respiratoire a été abaissée à environ 1/s. Fournir un soutien thermique à travers le coussin chauffant jusqu’à la confirmation de l’euthanasie. Préparez du formol tamponné neutre (FBN) à 10 % et du PBS avec 10 unités d’héparine par mL.REMARQUE : Les solutions doivent être à 4 °C. Versez chaque tampon dans des tubes séparés de 50 mL et connectez-vous, puis amorcez une pompe péristaltique reliée à un cathéter papillon de 25 G avec une solution PBS/héparine. Attachez les membres à un tampon bleu absorbant avec du ruban adhésif et assurez-vous que l’animal est placé en position couchée sur le dos. Désinfectez la fourrure pour éviter la contamination croisée des organes périphériques au cas où ils auraient besoin d’être collectés. Ouvrir la cavité péritonéale par une incision transversale, exposant le diaphragme. Ouvrir la cage thoracique par deux coupes de ciseaux chirurgicaux le long de l’axe antérieur / postérieur. Exposez le cœur et placez l’aiguille dans une cavité gauche (côté droit du cœur vu en décubitus dorsal) et placez-la dans le cathéter papillon à l’étape 9.1.3. Faites une petite incision dans le ventricule droit pour permettre l’écoulement du sang. Allumez la pompe péristaltique pour commencer à évacuer le sang avec du PBS/héparine.REMARQUE : Si cette étape n’est pas effectuée de manière adéquate, le sang coagulera lors de la fixation au formol et empêchera une perfusion appropriée. Une fois que tout le sang est évacué et que le PBS clair commence à sortir du ventricule droit, passez l’entrée d’une pompe péristaltique à une solution de FBN et commencez la perfusion pour 25 ml par souris. Extraire le cerveau, le placer dans au moins 4 mL de NBF et post-fixer pendant 24 h. Sectionnez le cerveau à l’aide de sections coronales sur un vibratome en utilisant une épaisseur de section de 50 μm. Placez chaque section dans un puits d’une plaque de 24 puits stockant les sections dans tout le cerveau. Évaluer l’expression des récepteurs chimiogénétiques fusionnés à des protéines fluorescentes (p. ex., mCherry ou mCitrine), au microscope fluorescent afin d’identifier les sections présentant une expression pour confirmer l’emplacement. L’expression est susceptible d’être faible. Effectuez l’immunomarquage contre le fluorophore en suivant le protocole suivant :Placer 3 sections dans 0,5 mL de solution contenant 10 % de sérum d’un hôte d’un anticorps secondaire et incuber pendant 30 minutes. Transférez les coupes dans une solution d’anticorps primaire à une dilution de 1 :250 à 1 :1 000, en utilisant 1 :500 comme point de départ. Incuber les coupes avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C dans une microplaque scellée avec un film de paraffine. Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois. Ajouter 0,5 mL par puits de la solution d’anticorps secondaire dans le sérum à 10 %. Incuber pendant 4 h à température ambiante. Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois. Montage sur lames avec un milieu de montage aqueux contenant une coloration nucléaire (par exemple, DAPI). Évaluez la localisation et la propagation à l’aide d’un microscope confocal en effectuant un balayage en tuiles d’une section entière. Évaluez l’intensité de l’expression en mesurant l’intensité des pixels de fluorescence dans les régions cérébrales ciblées et comparez-les à celles d’un témoin injecté par voie intracrânienne. Vous pouvez également évaluer le pourcentage de neurones positifs en comptant les cellules colorées par rapport aux récepteurs chimiogénétiques, par rapport aux cellules DAPI-positives ou aux marqueurs spécifiques des cellules. Évaluez les lésions tissulaires en effectuant une coloration à l’hématoxyline sur une section de 50 μm et en effectuant une imagerie pour détecter la perte de cellules, l’accumulation de débris cellulaires et d’autres signes de dommages importants. Pour évaluer la spécificité du ciblage cellulaire, effectuez un double immunomarquage comme décrit ci-dessous pour le récepteur chimiogénétique et un marqueur spécifique de la cellule. Ensuite, effectuez des comptages de cellules positives comme à l’étape 9.8.Placer 3 sections dans 0,5 mL d’une solution contenant 10 % de sérum d’un hôte d’un anticorps secondaire et incuber pendant 30 min. Transférez les coupes dans une solution d’anticorps primaire contre un marqueur fluorescent d’un récepteur chimiogénétique à une dilution de 1 :250 à 1 :1 000, en utilisant 1 :500 comme point de départ. Ajouter un deuxième anticorps primaire provenant d’une autre espèce hôte qui est ciblé contre un marqueur d’intérêt spécifique à la cellule (p. ex., CamkIIa). Incuber les coupes avec l’anticorps primaire pendant une nuit à 4 °C dans une microplaque scellée avec un film de paraffine. Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois. Ajouter 0,5 mL par puits de solution d’anticorps secondaires dans 10 % de sérum de l’espèce-hôte des deux anticorps secondaires.REMARQUE : Chaque anticorps doit avoir un fluorophore distinct et doit être réactif contre les anticorps primaires à l’étape 9.10.2. Incuber pendant 4 h à température ambiante. Lavez les sections avec du PBS, 3x pendant 5 min à la fois. Monter sur des lames et fixer avec un milieu de montage aqueux contenant une coloration nucléaire. 10. Évaluer l’activation neuronale avec l’immunomarquage pour les c-Fos Effectuer la coloration c-Fos comme au point 9.5 de ce protocole à l’aide d’un anticorps primaire c-Fos et d’un anticorps secondaire avec un marqueur fluorescent distinct de la coloration nucléaire. Comptez le pourcentage de cellules qui sont positives à la fois pour le c-Fos et la coloration nucléaire dans la zone ciblée par un récepteur chimiogénétique. Analyser le pourcentage de noyaux c-Fos positifs dans un groupe de souris exprimant des récepteurs chimiogénétiques et traitées avec un ligand chimiogénétique ou un contrôle de véhicule et dans un groupe de souris de type sauvage traitées avec un ligand chimiogénétique ou un contrôle de véhicule.