Gerichte echografie geïnduceerde bloed-hersenbarrièreopening voor het richten op hersenstructuren en het evalueren van chemogenetische neuromodulatie

Alle experimenten werden uitgevoerd onder een protocol dat was goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het California Institute of Technology, waar de gegevens oorspronkelijk werden verkregen door J.O.S. 1. Ontwerp en 3D-printen van dierenharnassen en beeldgeleidingshardware Gebruik de bestanden van de Szablowski lab website op: https://www.szablowskilab.org/downloads voor 3D-printen van de componenten. Zorg ervoor dat het printmateriaal een lage gevoeligheid heeft voor MRI, maar een MRI-zichtbare ondersteuning heeft. Zie de details van de gebruikte materialen in de sectie materialen en reagentia. Houd rekening met de materiaaldegradatie bij meerdere toepassingen door het materiaal herhaaldelijk te testen en de slijtageplaatsen te observeren die moeten worden versterkt. Zorg ervoor dat de geprinte wanden minstens 2 mm dik zijn. Gebruik zeer nauwkeurige 3D-printers om de targetingprecisie te verbeteren. Ga de zwaartekracht en andere krachten tegen om afwijking van plastic 3D-geprinte componenten te voorkomen door de componenten over hun lengte te ondersteunen en de dikte van de 3D-geprinte wanden te vergroten als er een buiging wordt waargenomen. Houd rekening met precisie in meerdere assen, waaronder voorste / achterste, mediale / laterale, dorsale / ventrale, evenals gier, toonhoogte en kanteling. Test de nauwkeurigheid van targeting door FUS-BBBO uit te voeren en de afwijking van de beoogde positie te registreren. Als u gemotoriseerde stereotaxische systemen gebruikt, evalueer dan op de effecten van dynamische beweging op de materiaalelasticiteit door de FUS-BBBO-targetingprocedure op video vast te leggen en corrigeer eventuele afwijkingen door de wanden van 3D-geprint materiaal te verdikken. 2. Beschrijving van het echografiesysteem Gebruik een ultrasoon systeem met een acht-elementen ringvormige array-transducer (diameter = 25 mm, natuurlijk brandpunt = 20 mm; diafragma (F) = 0,8)) en koppel de behuizing aan het hoofd met ontgaste ultrasone gel door gel aan te brengen op de geschoren muizenkop.OPMERKING: De middenfrequentie van een transducer die in een eerdere studiewerd gebruikt 7 was 1,5 MHz, de pulsduur was 10 ms en de pulsherhalingsfrequentie was 1 Hz over 120 s. De drukken werden gekalibreerd met behulp van optische vezel hydrofoon en gehandhaafd tussen 0,36-0,45 MPa. Ga uit van 18% akoestische demping door de schedel21 voor 1,5 MHz en pariëtaal bot. De reeks voorwaarden die geschikt zijn voor een veilige BBB-opening en AAV-levering zijn elders in detail beschreven 7,14,22. 3. Voorbereiding van dieren Verdoof één muis met isofluraaninhalatie bij 2% met lucht van medische kwaliteit. Controleer de diepte van de anesthesie door een aanraking knijpen om het gebrek aan respons te bevestigen. Breng vervolgens oogheelkundige zalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen met behulp van een steriele q-tip voor eenmalig gebruik om kruisbesmetting van de zalfbuis te voorkomen.OPMERKING: Typische procedure van FUS-BBBO kan variëren van 30 minuten tot 2 uur, en anesthesie moet gedurende de hele periode worden gehandhaafd. Nadat de muis is verdoofd, wast u een schone katheter met een gehepariniseerde zoutoplossing (10 E/ml).OPMERKING: Een geschikte katheter voor een muis van 25-35 g heeft een naald van 30 G en een PE10-slang. Desinfecteer vervolgens muizenstaart met 70% ethanol pad. Plaats de staartaderkatheter in een laterale staartader en zet deze vast met een weefsellijm. Observeer een terugstroom van bloed uit de staartader naar de katheter om de plaatsing ervan te bevestigen. Scheer de muizenkop en gebruik vervolgens ontharingscrème nadat de weefsellijm is opgedroogd om de kans te verkleinen dat luchtbellen tijdens insonatie onder ultrasone gel worden gevangen. Plaats de muis in een 3D-geprinte MRI-wagen, monteer de voortanden op een bijtbalk en kop in een neuskegel (figuur 1a). Injecteer tot 10 μL lidocaïne subcutaan op de plaats die in contact komt met de stompe oorbalken. Bevestig vervolgens de stompe staven aan de schedel en oefen veilige hoeveelheden druk uit, zorg ervoor dat u geen druk uitoefent op de luchtpijp omdat dit de ademhaling belemmert. Observeer de ademhaling gedurende 30 s om te bevestigen dat het dier vrij ademt met een snelheid van 1/s. Sluit de richtgids aan op oorbalken, controleer de ademhaling zoals in stap 3.6 (figuur 1b) en blijf de ademhaling elke minuut visueel volgen tijdens de procedure. Een ademhalingsfrequentie verhoogd boven 1 /s is een van de indicaties van verlies van anesthesie. Blijf de teenknijprespons elke 5 minuten controleren wanneer muizen niet in de MRI-scanner zitten of als de ademhalingsfrequentie hoger is dan 1/s. Breng de MRI-wagen over in een MRI-houder en vervolgens in de boring van een magneet.OPMERKING: Het ontwerp van de hardware is geoptimaliseerd voor een spoel van 72 mm in een 7T MRI. Verkrijg een MRI-sequentie om de muis in de scanner te lokaliseren. Selecteer de 3D fast low angle shot (FLASH)-reeks om de volledige hersenen te verkrijgen, met behulp van de volgende parameters, volgens specifieke instructies van de instrumentfabrikant. Echotijd: 3,9 ms, Herhalingstijd: 15 ms, Excitatiepulshoek: 15°, Matrixgrootte: 130 x 130 x 114, Resolutie: 350 x 200 x 200 μm per voxel, Gemiddelden: 1, Acquisitietijd: 3 min 42s Breng bestanden over van het MRI-systeem naar een computer die FUS-systeem bestuurt. Open de beeldvormingssequentie in de software om MRI-geleide targeting uit te voeren, waarbij het beeld moet verschijnen zoals in figuur 1c. 4. MRI-geleide targeting OPMERKING: Met het gebruik van op maat ontworpen targetinggidsen is het niet nodig om een ultrasone transducer in een MRI te plaatsen, noch is het nodig om de huid in te snijden om targeting uit te voeren door de stereotaxis op bregma- en lambda-lijnen op nul te zetten. Volg de onderstaande stappen om het targetingproces uit te voeren. Plaats de wagen in een stereotaxisch instrument. Bevestig het op zijn plaats met behulp van een metalen blok met een dubbelzijdige tape en door de wagen tegen twee steunpalen van het stereotaxische instrument te drukken. Breng MRI-beelden over naar een computer met een actieve FUS-begeleidingssoftware door bestanden te selecteren in gegevensbeheer, met de rechtermuisknop te klikken om menuopties weer te geven en ‘Onmiddellijk overzetten’ te selecteren. Open de FUS-geleidingssoftware en laad de afbeelding door op ‘Sequentie openen’ te klikken en alle bestanden van de beeldsequentie te laden. Formatteer de afbeelding opnieuw naar drie assen door met de rechtermuisknop op ‘Opnieuw formatteren’ te drukken. Lokaliseer de transducer naar de cirkelvormige targetinggids (afbeelding 1c) door met de rechtermuisknop te klikken. Pas in de sagittale weergave de verticale positie van een virtuele transducer aan om rekening te houden met de dikte van het waterbad en de behuizing van de transducer (in dit geval – 8,2 mm naar boven, figuur 1d). Wijs de gebieden aan die moeten worden getarget in de trajectplanner en noteer de coördinaten in een spreadsheet (in dit geval middenhersenen, zoals in figuur 1d). Kies de gewenste diepte van targeting (z-waarde in elektronisch traject (figuur 2) en noteer coördinaten in een spreadsheet. Richt je op elk van de punten door op ‘Traject verzenden’ en ‘Uitvoeren’ te drukken (figuur 2).OPMERKING: Dit wordt gedaan wanneer een muisdrager in de motoren wordt geplaatst. Dezelfde targeting kan echter met hoge nauwkeurigheid worden bereikt op een stereotaxisch instrument. Om de coördinaten van een MRI te correleren met het stereotaxische frame, plaatst u de op maat gemonteerde transducer over een richtgeleider en vertaalt u totdat elk van de drie richtbouten (figuur 3, element A) door zowel de transducerhouder (figuur 3, element B) als de richtgeleider (figuur 3, element C) kan gaan. Controleer of de bouten niet onder spanning staan of kantelen. Vertaal de transducer 10,56 mm naar voren in voorste/achterste richting totdat deze zich op dezelfde plaats bevindt waar een midden van een richtgeleider op een MRI verschijnt. Bepaal de afstand van een middelpunt van de virtuele transducer (figuur 3a, element A) tot het doelgebied (figuur 3a, element B) en verplaats de transducer naar deze coördinaten met behulp van stereotaxisch frame. Ga verder met de bereiding van de injectie-oplossing. 5. Bereiding van de injectieoplossing OPMERKING: De microbubbeloplossingen zijn zeer gevoelig voor druk. Bijgevolg kan krachtig mengen of snelle injectie door dunne naalden de microbubbels instorten en de werkzaamheid van BBB-opening verminderen. Bovendien zijn microbubbels lichter dan water en kunnen ze naar de bovenkant van een buis, katheter of spuit drijven (figuur 4), bijvoorbeeld in een automatische injector. Het wordt sterk aanbevolen om microbubbeloplossing onmiddellijk voor elke injectie te resuspenderen. Zuig 0,8 ml zoutoplossing op met een spuit in een tube van 1,5 ml. Voeg met een spuit 0,1 ml MRI-contrastmiddel toe aan dezelfde buis van 1,5 ml en meng. Breng de niet-geactiveerde microbubbel23,24 oplossing op kamertemperatuur. Activeer vlak voor de insonatie microbubbels gedurende 45 s in een microbubbel-activeringsapparaat. Trek langzaam (meer dan ~ 3 s) 0,1 ml microbubbels op met behulp van een 1 ml tuberculinespuit en een naald van 21 g uit de middelste diepte van een vloeistof. Voeg 0,08 ml microbubbels toe aan de oplossing van contrastmiddel en zoutoplossing bereid in stap 5.3. Meng door 15 s met de hand te tikken. Met een uiteindelijke concentratie van AAV’s van 0,5-2 x 10 10 virale deeltjes per gram lichaamsgewicht (VP/g), injecteert u de lading voor levering (in dit geval AAV9) via een naald van30 G in de staartaderkatheter, in het geval van ATAC – AAV’s met chemogenetische receptoren, of een negatieve controle, zoals AAV’s die GFP onder dezelfde promotor dragen. Meng microbubbels opnieuw met de hand gedurende 15 s om drijven te voorkomen (figuur 4). Zuig onmiddellijk daarna 200 μL van de microbubbeloplossing op door een spuit zonder naald. Het ontbreken van een naald zal de schuifkrachten op microbubbels verminderen. Keer de spuit om en meng door de zuiger op en neer te drukken. Bevestig de naald van 30 G en duw, terwijl deze nog steeds omgekeerd is, de microbubbels langzaam naar buiten totdat er druppeltjes aan het einde van een naald verschijnen. 6. Insonatieprocedure Stel de parameters voor insonatie in: 10 ms pulsduur, 120 herhalingen, elke s en 0,30-0,45 MPa druk op de schedel. Verwijder de richtgeleider en breng ontgaste ultrasone gel aan op de muiskop, zorg ervoor dat er geen bubbels ontstaan. Laat de transducer zakken en plaats deze direct op de oorbalkhouder en kies de coördinaten in de stereotaxische instrumenten (figuur 5). Injecteer de oplossing van AAV (0,5-2 x 1010 VP/g). Meng microbubbels en de MRI-contrastmiddeloplossing gedurende 15 s en injecteer in 80 μL per 30 g muis. Breng onmiddellijk echografie aan gedurende 120 s door op ‘Verzenden’ en ‘Uitvoeren’ te drukken. Als meer dan één site is getarget, verplaatst u de transducer naar die site en past u de dieptetargeting aan volgens de volgende getallen in de spreadsheet uit stap 4.7-4.9. Herhaal vervolgens stap 6.5-6.6 voor elke insonerende site. 7. MRI-evaluatie van BBB-opening OPMERKING: De MRI-evaluatie van de BBB-opening is elders in detail beschreven11. De locatie van BBB-opening kan worden gevisualiseerd als helderdere gebieden bij muizen die een injectie van een T1-gewogen Gd-contrastmiddel hebben gekregen. Neem na de echografie een MRI-sequentie op zoals in stap 3.10. Verwijder de muis uit de MRI-scanner en plaats deze in een herstelkooi om herstel van anesthesie mogelijk te maken. Controleer de muizen dagelijks op tekenen van nood, gewichtsverlies of andere humane eindpunten. Raadpleeg veterinair personeel en de institutionele IACUC-richtlijnen om door te gaan met elke behandeling als er onverwachte bijwerkingen optreden. 8. GEVREESDE stimulatie met een chemogenetisch ligand Kies een chemogenetische receptor. Kies voor DREADDs de hM3Dq-receptor voor neuronale activering via Gq-gekoppelde routes19, de hM4Di-receptor voor remming van neuronale activiteit via Gi / o-gekoppelde routes20, of de KORD-receptor voor activering van neuronen via Gs-gekoppelde routes met Salvinorin-B-ligand25. Los clozapine-n-oxide (CNO) op in steriele zoutoplossing in een concentratie van 1 mg/ml. Bewaar de gealiquoteerde CNO bij -20 °C. Dien CNO19, of een andere chemogenetische ligand26,27,28, toe via intraperitoneale route bij een concentratie tussen 0,3 – 10 mg/kg. Als effecten van CNO op gedrag moeten worden geregistreerd, begin dan met het registreren van de gedragsactiviteit binnen 15-45 minuten na toediening van het geneesmiddel om de maximale activering van DREADDs19 te bereiken. Als analyse van neuronale activering gewenst is, gebruik dan muizen voor histologische evaluatie na 60-120 minuten na injectie. Ga over tot euthanasie door middel van hartperfusie (zie rubriek 9). 9. Histologische evaluatie van genexpressie en chemogenetische activatie OPMERKING: Zodra het experimentele eindpunt (bijv. einde van gedragsstudie, tijd die nodig is voor genexpressie) is bereikt, is het van cruciaal belang om de locatie en aanwezigheid van de genexpressie te bevestigen. Na activering met een chemogenetisch ligand, voer hartperfusie uit om weefsels te behouden.Verdoof de muis met ketamine (100 mg/kg) /Xylazine (10 mg/kg) mengsel in steriele zoutoplossing door middel van een IP-injectie. Bevestig de anesthesie met een teenknijper en zorg ervoor dat de ademhalingsfrequentie is verlaagd tot ongeveer 1/s. Zorg voor thermische ondersteuning via het verwarmingskussen tot de bevestiging van euthanasie. Bereid 10% neutraal gebufferd formaline (NBF) en PBS met 10 eenheden heparine per ml.OPMERKING: Oplossingen moeten bij 4 °C zijn. Giet elke buffer in afzonderlijke buizen van 50 ml en sluit deze aan en bereid een peristaltische pomp voor die is aangesloten op een vlinderkatheter van 25 G met PBS / heparine-oplossing. Bevestig de ledematen aan een absorberende blauwe pad met tape en zorg ervoor dat het dier in rugligging op het kussen wordt geplaatst. Desinfecteer de vacht om kruisbesmetting van perifere organen te voorkomen voor het geval ze moeten worden verzameld. Open de peritoneale holte door een transversale incisie, waardoor het diafragma wordt blootgesteld. Open de ribbenkast door twee sneden chirurgische schaar langs de voorste / achterste as. Stel het hart bloot en plaats de naald in een linkerkamer (rechterkant van het hart zoals liggend gezien) en plaats de vlinderkatheter in stap 9.1.3. Maak een kleine incisie in de rechter ventrikel om bloeduitstroom mogelijk te maken. Zet de peristaltische pomp aan om te beginnen met het wegspoelen van het bloed met PBS / heparine.OPMERKING: Als deze stap niet adequaat wordt uitgevoerd, zal het bloed stollen tijdens fixatie met formaline en de juiste perfusie voorkomen. Nadat al het bloed is weggespoeld en heldere PBS uit de rechterkamer begint te komen, schakelt u de inlaat van een peristaltische pomp over naar een NBF-oplossing en begint u met perfusie gedurende 25 ml per muis. Extraheer de hersenen, plaats in ten minste 4 ml NBF en post-fix gedurende 24 uur. Sectie de hersenen met behulp van coronale secties op een vibratoom met een dikte van 50 μm sectie. Plaats elke sectie in een put van een 24-putplaat die de secties in de hersenen opslaat. Evalueer de expressie van de chemogenetische receptoren gefuseerd met fluorescerende eiwitten (bijv. mCherry of mCitrine), onder een fluorescerende microscoop om de secties te identificeren die expressie tonen om de locatie te bevestigen. De uitdrukking is waarschijnlijk zwak. Voer immunokleuring uit tegen de fluorofoor met behulp van het volgende protocol:Plaats 3 secties in 0,5 ml oplossing met 10% serum van een gastheer van een secundair antilichaam en incubeer gedurende 30 minuten. Breng de secties over in een oplossing van een primair antilichaam met een verdunning van 1:250 – 1:1.000, met 1:500 als uitgangspunt. Incubeer de secties met primair antilichaam gedurende een nacht bij 4 °C in een microplaat afgesloten met een paraffinefilm. Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer. Voeg 0,5 ml per putje van de secundaire antilichaamoplossing toe in 10% serum. Incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer. Monteer op dia’s met een waterig montagemedium dat een nucleaire vlek bevat (bijv. DAPI). Evalueer de lokalisatie en verspreiding met behulp van een confocale microscoop door een tegelscan van een hele sectie uit te voeren. Evalueer de intensiteit van expressie door de fluorescentiepixelintensiteit in gerichte hersengebieden te meten en te vergelijken met een intracranieel geïnjecteerde controle. Als alternatief, evalueer het percentage positieve neuronen door cellen te tellen die zijn gekleurd tegen chemogenetische receptoren, in vergelijking met DAPI-positieve cellen of celspecifieke markers. Evalueer de weefselschade door hematoxylinekleuring uit te voeren op een sectie van 50 μm en beeldvorming voor het verlies van cellen, ophoping van celresten en andere tekenen van grove schade. Om de specificiteit van celtargeting te evalueren, voert u dubbele immunostaining uit zoals hieronder beschreven voor de chemogenetische receptor en een celspecifieke marker. Voer vervolgens celpositieve tellingen uit zoals in stap 9.8.Plaats 3 secties in 0,5 ml van een oplossing met 10% serum van een gastheer van een secundair antilichaam en incubeer gedurende 30 minuten. Breng de secties over in een oplossing van een primair antilichaam tegen een fluorescerende marker van een chemogenetische receptor bij 1:250 – 1:1.000 verdunning, met 1:500 als uitgangspunt. Voeg een tweede primair antilichaam toe van een andere gastheersoort dat is gericht tegen een celspecifieke marker van belang (bijv. CamkIIa). Incubeer de secties met primair antilichaam gedurende een nacht bij 4 °C in een microplaat afgesloten met paraffinefilm. Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer. Voeg 0,5 ml per put secundaire antilichaamoplossing toe aan 10% serum van de gastheersoort van beide secundaire antilichamen.OPMERKING: Elk antilichaam moet een afzonderlijke fluorofoor hebben en moet reactief zijn tegen primaire antilichamen in stap 9.10.2. Incubeer gedurende 4 uur bij kamertemperatuur. Was de secties met PBS, 3x gedurende 5 minuten per keer. Monteer op dia’s en bevestig met een waterig montagemedium dat een nucleaire vlek bevat. 10. Evalueer neuronale activatie met immunostaining voor c-Fos Voer c-Fos-kleuring uit zoals in punt 9.5 van dit protocol met behulp van een c-Fos primair antilichaam en een secundair antilichaam met een fluorescerend label dat verschilt van de nucleaire vlek. Tel het percentage cellen dat positief is voor zowel c-Fos als nucleaire kleuring in het gebied dat het doelwit is van een chemogenetische receptor. Analyseer het percentage c-Fos-positieve kernen in een groep muizen die chemogenetische receptoren tot expressie brengen en worden behandeld met een chemogenetische ligand of voertuigcontrole en in een groep wild-type muizen die worden behandeld met een chemogenetische ligand of voertuigcontrole.