Beyin Yapılarını Hedeflemek ve Kemogenetik Nöromodülasyonu Değerlendirmek için Odaklanmış Ultrason Kaynaklı Kan-Beyin Bariyeri Açılması

Tüm deneyler, verilerin orijinal olarak J.O.S. tarafından elde edildiği Kaliforniya Teknoloji Enstitüsü’nün Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kapsamında gerçekleştirildi. 1. Hayvan koşum takımı ve görüntü rehberlik donanımının tasarımı ve 3D baskısı Bileşenlerin 3D baskısı için https://www.szablowskilab.org/downloads adresindeki Szablowski laboratuvarı web sitesindeki dosyaları kullanın. Baskı malzemesinin MRG’de düşük duyarlılığa sahip olduğundan ancak MRG tarafından görülebilen bir desteğe sahip olduğundan emin olun. Malzemeler ve reaktifler bölümünde kullanılan malzemelerin ayrıntılarına bakın. Malzemeyi tekrar tekrar test ederek ve güçlendirilmesi gereken aşınma yerlerini gözlemleyerek birden fazla kullanımla malzeme bozulmasını hesaba katın. Yazdırılan duvarların en az 2 mm kalınlığında olduğundan emin olun. Hedefleme hassasiyetini artırmak için yüksek hassasiyetli 3D yazıcılar kullanın. Bileşenleri uzunlukları boyunca destekleyerek ve herhangi bir bükülme gözlemlenirse 3D baskılı duvarların kalınlığını artırarak plastik 3D baskılı bileşenlerin sapmasını önlemek için yerçekimi ve diğer kuvvetlere karşı koyun. Anterior/posterior, medial/lateral, dorsal/ventral ve ayrıca sapma, eğim ve eğim dahil olmak üzere birden fazla eksende hassasiyeti hesaba katın. FUS-BBBO gerçekleştirerek ve hedeflenen konumdan sapmayı kaydederek hedeflemenin doğruluğunu test edin. Motorlu stereotaksik sistemler kullanılıyorsa, FUS-BBBO hedefleme prosedürünü videoya kaydederek dinamik hareketin malzeme esnekliği üzerindeki etkilerini değerlendirin ve 3D baskılı malzeme duvarlarını kalınlaştırarak sapmaları düzeltin. 2. Ultrason sistemi açıklaması Sekiz elemanlı dairesel dizi dönüştürücülü bir ultrason sistemi kullanın (çap = 25 mm, doğal odak noktası = 20 mm; açıklık (F) = 0.8)) ve traşlı fare kafasına jel uygulayarak gövdeyi gazdan arındırılmış ultrason jeli ile kafaya bağlayın.NOT: Önceki bir çalışmada7 kullanılan bir dönüştürücünün merkez frekansı 1.5 MHz, darbe süresi 10 ms ve darbe tekrarlama frekansı 120 sn üzerinde 1 Hz idi. Basınçlar fiber optik hidrofon kullanılarak kalibre edildi ve 0.36-0.45 MPa arasında tutuldu. 1.5 MHz ve parietal kemik için kafatası21 boyunca% 18 akustik zayıflama olduğunu varsayalım. Güvenli bir BBB açılması ve AAV teslimatı için uygun koşullar aralığı başka bir yerde ayrıntılı olarakaçıklanmıştır 7,14,22. 3. Hayvan hazırlama Tıbbi sınıf hava ile% 2’de izofluran inhalasyonu kullanarak bir fareyi uyuşturun. Yanıt eksikliğini doğrulamak için anestezi derinliğini bir tutam dokunuşla kontrol edin. Ardından, merhem tüpünün çapraz kontaminasyonunu önlemek için tek kullanımlık steril bir q-ucu kullanarak kornea kurumasını önlemek için oftalmik merhem uygulayın.NOT: FUS-BBBO’nun tipik prosedürü 30 dakika ile 2 saat arasında değişebilir ve anestezi boyunca sürdürülmelidir. Fare uyuşturulduktan sonra, temiz bir kateteri heparinize salin (10 U / ml) ile yıkayın.NOT: 25-35 g’lık bir fare için uygun bir kateterde 30 G’lık bir iğne ve PE10 hortumu bulunur. Daha sonra fare kuyruğunu% 70 etanol pedi ile dezenfekte edin. Kuyruk ven kateterini lateral bir kuyruk damarına yerleştirin ve bir doku yapıştırıcısı ile sabitleyin. Yerleşimini doğrulamak için kuyruk damarından katetere geri kan akışını gözlemleyin. Fare kafasını tıraş edin ve ardından insonasyon sırasında ultrasonik jel altında hava kabarcıklarının sıkışma olasılığını azaltmak için doku yapıştırıcısı kuruduktan sonra epilasyon kremi kullanın. Fareyi 3D baskılı bir MRI taşıyıcısına yerleştirin, ön dişleri bir ısırma çubuğuna monte edin ve bir nosekonun içine yerleştirin (Şekil 1a). Körelmiş kulak çubuklarına temas eden bölgeye deri altından 10 μL’ye kadar lidokain enjekte edin. Ardından, körelmiş çubukları kafatasına sabitleyin ve nefes almayı engellediği için nefes borusuna baskı uygulamamaya dikkat ederek güvenli miktarda basınç uygulayın. Hayvanın 1/s hızında serbestçe nefes aldığını doğrulamak için solunumu 30 saniye gözlemleyin. Hedefleme kılavuzunu kulak çubuklarına bağlayın, adım 3.6’da (Şekil 1b) olduğu gibi solunumu kontrol edin ve prosedür boyunca her dakika görsel olarak solunumu izlemeye devam edin. Solunum hızının 1/s’nin üzerine çıkması anestezi kaybının göstergelerinden biridir. Fareler MRI tarayıcısında değilken veya solunum hızı 1 / s’nin üzerine çıktığında her 5 dakikada bir ayak parmağı sıkışma tepkisini izlemeye devam edin. MRI taşıyıcısını bir MRI tutucusuna ve ardından bir mıknatısın deliğine aktarın.NOT: Donanımın tasarımı, 7T MRI içindeki 72 mm’lik bir bobin için optimize edilmiştir. Fareyi tarayıcıda lokalize etmek için bir MRI dizisi edinin. Cihaz üreticisinin özel talimatlarına göre aşağıdaki parametreleri kullanarak beynin tamamını elde etmek için 3D hızlı düşük açılı çekim (FLASH) dizisini seçin. Yankı süresi: 3,9 ms, Tekrarlama süresi: 15 ms, Uyarma darbe açısı: 15°, Matris boyutu: 130 x 130 x 114, Çözünürlük: voksel başına 350 x 200 x 200 μm, Ortalamalar: 1, Edinme süresi: 3 dakika 42 sn Dosyaları MRI sisteminden FUS sistemini kontrol eden bir bilgisayara aktarın. Görüntünün Şekil 1c’deki gibi görünmesi gereken MRI kılavuzluğunda hedefleme gerçekleştirmek için yazılımda görüntüleme dizisini açın. 4. MRI kılavuzluğunda hedefleme NOT: Özel olarak tasarlanmış hedefleme kılavuzlarının kullanılmasıyla, ultrason dönüştürücüsünün bir MRI içine yerleştirilmesi veya bregma ve lambda hatlarında stereotax’ı sıfırlayarak hedefleme yapmak için cildi kesmek gerekli değildir. Hedefleme işlemini gerçekleştirmek için aşağıdaki adımları izleyin. Taşıyıcıyı stereotaksik bir aletin içine yerleştirin. Çift taraflı bantlı metal bir blok kullanarak ve taşıyıcıyı stereotaksik aletin iki destek direğine bastırarak yerine sabitleyin. Veri yöneticisinde dosyaları seçerek, menü seçeneklerini getirmek için sağ tıklayarak ve ‘Hemen aktar’ı seçerek MRI görüntülerini çalışan bir FUS rehberlik yazılımı olan bir bilgisayara aktarın. FUS kılavuz yazılımını açın ve ‘Diziyi aç’a tıklayarak ve görüntüleme dizisinin tüm dosyalarını yükleyerek görüntüyü yükleyin. Sağ tıklayıp ‘Yeniden Biçimlendir’ düğmesine basarak görüntüyü üç eksene yeniden biçimlendirin. Sağ tıklayarak dönüştürücüyü dairesel hedefleme kılavuzuna (Şekil 1c) konumlandırın. Sagital görünümde, su banyosunun ve dönüştürücü muhafazasının kalınlığını hesaba katmak için sanal bir dönüştürücünün dikey konumunu ayarlayın (bu durumda – 8.2 mm yukarı, Şekil 1d). Yörünge planlayıcısında hedeflenecek alan(lar)ı işaretleyin ve koordinatları bir elektronik tabloya not edin (bu durumda – Şekil 1d’deki gibi orta beyin). İstenilen hedefleme derinliğini çevirin (elektronik yörüngedeki z değeri (Şekil 2) ve bir elektronik tablodaki koordinatları not edin. ‘Yörünge gönder’ ve ‘Yürüt’ tuşlarına basarak noktaların her birini hedefleyin (Şekil 2).NOT: Bu, motorların içine bir fare taşıyıcısı yerleştirildiğinde yapılır. Bununla birlikte, aynı hedefleme stereotaksik bir cihazda yüksek doğrulukla elde edilebilir. Bir MRG’nin koordinatlarını stereotaksik çerçeve ile ilişkilendirmek için, özel olarak monte edilmiş dönüştürücüyü bir hedefleme kılavuzunun üzerine yerleştirin ve üç hedefleme cıvatasının her biri (Şekil 3, eleman A) hem transdüser tutucusundan (Şekil 3, eleman B) hem de hedefleme kılavuzundan (Şekil 3, eleman C) geçene kadar çevirin. Cıvataların gerilim altında olmadığından veya eğilmediğinden emin olun. Dönüştürücüyü, bir MRI’da bir hedefleme kılavuzunun merkezinin göründüğü yere gelene kadar ön/arka yönde 10.56 mm ileri çevirin. Sanal dönüştürücünün bir merkezinden (Şekil 3a, eleman A) hedeflenen bölgeye (Şekil 3a, eleman B) olan mesafeyi belirleyin ve stereotaksik çerçeve kullanarak dönüştürücüyü bu koordinatlara taşıyın. Enjeksiyon çözeltisinin hazırlanmasına devam edin. 5. Enjeksiyon çözeltisi hazırlama NOT: Mikro kabarcık çözeltileri basınca karşı çok hassastır. Sonuç olarak, ince iğnelerle kuvvetli karıştırma veya hızlı enjeksiyon, mikro kabarcıkları çökertebilir ve BBB açılmasının etkinliğini azaltabilir. Ek olarak, mikro kabarcıklar sudan daha hafiftir ve örneğin otomatik bir enjektörde bir tüpün, kateterin veya şırınganın (Şekil 4) tepesine kadar yüzebilir. Her enjeksiyondan hemen önce mikro kabarcık solüsyonunun yeniden süspanse edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bir şırınga kullanarak 0.8 mL salini 1.5 mL’lik tüpe çekin. Bir şırınga kullanarak, aynı 1.5 mL’lik tüpe 0.1 mL MRI kontrast maddesi ekleyin ve karıştırın. Aktive edilmemiş microbubble23,24 çözeltisini oda sıcaklığına getirin. İnsonasyondan hemen önce, bir mikro kabarcık aktivasyon cihazında 45 saniye boyunca mikro kabarcıkları etkinleştirin. Yavaşça (~ 3 saniyeden fazla) 1 mL tüberkülin şırıngası ve 21 G iğne kullanarak bir sıvının orta derinliğinden 0,1 mL mikro kabarcık çekin. Adım 5.3’te hazırlanan kontrast madde ve salin çözeltisine 0.08 mL mikro kabarcık ekleyin. 15 saniye boyunca elinizle hafifçe vurarak karıştırın. AAV’lerin nihai konsantrasyonu vücut ağırlığının gramı başına 0.5-2 x10 10 viral partikül (VP/g) iken, kemogenetik reseptörler taşıyan ATAC – AAV’ler veya aynı promotör altında GFP taşıyan AAV’ler gibi negatif bir kontrol durumunda, teslimat için kargoyu (bu durumda AAV9) 30 G iğne yoluyla kuyruk ven kateterine enjekte edin. Yüzmeyi önlemek için mikro kabarcıkları tekrar 15 saniye boyunca elle karıştırın (Şekil 4). Hemen ardından, 200 μL mikro kabarcık solüsyonunu iğne takılı olmayan bir şırıngadan aspire edin. İğne eksikliği, mikro kabarcıklar üzerindeki kesme kuvvetlerini azaltacaktır. Şırıngayı ters çevirin ve pistonu yukarı ve aşağı bastırarak karıştırın. 30 G’lik iğneyi takın ve hala ters çevrilmişken, iğnenin ucunda damlacıklar görünene kadar mikro kabarcıkları yavaşça dışarı itin. 6. İnsonasyon prosedürü İnsonasyon için parametreleri ayarlayın: 10 ms darbe süresi, 120 tekrar, her sn ve kafatasında 0.30-0.45 MPa basınç. Hedefleme kılavuzunu çıkarın ve kabarcık oluşturmadığından emin olarak fare kafasına gazı alınmış ultrason jeli uygulayın. Dönüştürücüyü indirin ve doğrudan kulak çubuğu tutucusuna düz bir şekilde yerleştirin ve koordinatları stereotaksik aletlere çevirin (Şekil 5). AAV çözeltisini (0.5-2 x 1010 VP / g) enjekte edin. Mikro kabarcıkları ve MRI kontrast madde solüsyonunu 15 saniye boyunca karıştırın ve 30 g fare başına 80 μL enjekte edin. Hemen ‘Gönder’ ve ‘Yürüt’ tuşlarına basarak 120 saniye boyunca ultrason uygulayın. Birden fazla site hedefleniyorsa, dönüştürücüyü o siteye taşıyın ve 4.7-4.9 arasındaki adımlarda yer alan e-tablodaki sayılara göre derinlik hedeflemesini ayarlayın. Ardından, sonlanan her bölge için 6.5-6.6 arasındaki adımları tekrarlayın. 7. BBB açıklığının MRG değerlendirmesi NOT: BBB açıklığının MRG değerlendirmesi başka bir yerde ayrıntılı olarak açıklanmıştır11. BBB açıklığının yeri, T1 ağırlıklı bir Gd kontrast maddesi enjeksiyonu alan farelerde daha parlak alanlar olarak görselleştirilebilir. Ultrason uygulamasından sonra, adım 3.10’daki gibi bir MRI dizisi kaydedin. Fareyi MRI tarayıcısından çıkarın ve anesteziden iyileşmeyi sağlamak için bir kurtarma kafesine yerleştirin. Fareleri günlük olarak sıkıntı, kilo kaybı veya diğer insancıl uç noktalar için izleyin. Beklenmeyen advers olayların meydana gelmesi durumunda herhangi bir tedaviye devam etmek için veteriner personeline ve kurumsal IACUC yönergelerine danışın. 8. Kemogenetik ligand ile DREADD stimülasyonu Kemogenetik bir reseptör seçin. DREADD’ler için, Gq bağlı yollar19 aracılığıyla nöronal aktivasyon için hM3Dq reseptörünü, Gi / o bağlı yollar20 yoluyla nöronal aktivitenin inhibisyonu için hM4Di reseptörünü veya Salvinorin-B ligandı25 kullanılarak Gs bağlantılı yollar yoluyla nöronların aktivasyonu için KORD reseptörünü seçin. Klozapin-n-oksit (CNO) steril salin içinde 1 mg / mL konsantrasyonda çözün. Alıntılanan CNO’yu -20 °C’de saklayın. CNO 19 veya başka bir kemogenetik ligand26,27,28’i intraperitoneal yoldan 0.3 –10 mg / kg arasındaki konsantrasyonda uygulayın. CNO’nun davranış üzerindeki etkileri kaydedilecekse, DREADD’lerin maksimum aktivasyonunu elde etmek için ilaç uygulamasından sonra 15-45 dakika içinde davranışsal aktiviteyi kaydetmeye başlayın19. Nöronal aktivasyonun analizi isteniyorsa, enjeksiyondan 60-120 dakika sonra histolojik değerlendirme için fareler kullanın. Kardiyak perfüzyon yoluyla ötenaziye geçilmelidir (bkz. bölüm 9). 9. Gen ekspresyonunun ve kemogenetik aktivasyonun histolojik değerlendirmesi NOT: Deneysel son noktaya (örneğin, davranışsal çalışmanın sonu, gen ekspresyonu için gereken süre) ulaşıldıktan sonra, gen ekspresyonunun yerini ve varlığını doğrulamak çok önemlidir. Kemogenetik bir ligand ile aktivasyondan sonra, dokuları korumak için kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.Fareyi Ketamin (100 mg/kg) /Ksilazin (10 mg/kg) karışımı ile steril salin içinde IP enjeksiyonu ile uyuşturun. Anesteziyi bir ayak parmağı tutamıyla onaylayın ve solunum hızının yaklaşık 1 / s’ye düşürüldüğünden emin olun. Ötenazi onaylanana kadar ısıtma yastığı aracılığıyla termal destek sağlayın. % 10 nötr tamponlu formalin (NBF) ve PBS’yi mL başına 10 birim heparin ile hazırlayın.NOT: Çözeltiler 4 °C’de olmalıdır. Her tamponu ayrı 50 mL’lik tüplere dökün ve bağlayın ve PBS/heparin solüsyonu ile 25 G’lik bir kelebek katetere bağlı bir peristaltik pompayı doldurun. Uzuvları bantla emici mavi bir pede tutturun ve hayvanın ped üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirildiğinden emin olun. Toplanması gerektiğinde periferik organların çapraz kontaminasyonunu önlemek için kürkü dezenfekte edin. Diyaframı açığa çıkaran enine bir kesi ile periton boşluğunu açın. Göğüs kafesini ön / arka eksen boyunca iki kesik cerrahi makasla açın. Kalbi ortaya çıkarın ve iğneyi sol bir odaya yerleştirin (sırtüstü olarak bakıldığında kalbin sağ tarafı) ve adım 9.1.3’te kelebek katetere yerleştirin. Kan çıkışına izin vermek için sağ ventrikülde küçük bir kesi yapın. Kanı PBS / heparin ile yıkamaya başlamak için peristaltik pompayı açın.NOT: Bu adım yeterince yapılmazsa, formalin ile fiksasyon sırasında kan pıhtılaşacak ve uygun perfüzyonu önleyecektir. Tüm kan temizlendikten ve sağ ventrikülden temiz PBS çıkmaya başladıktan sonra, peristaltik bir pompanın girişini bir NBF çözeltisine çevirin ve fare başına 25 mL perfüzyona başlayın. Beyni çıkarın, en az 4 mL NBF’ye yerleştirin ve 24 saat boyunca düzeltin. 50 μm kesit kalınlığı kullanarak bir vibratom üzerinde koronal kesitler kullanarak beyni bölümlere ayırın. Her bölümü, bölümleri beyin boyunca depolayan 24 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin. Floresan proteinlere kaynaşmış kemogenetik reseptörlerin ekspresyonunu değerlendirin (örneğin, mCherry veya mSitrin), konumu doğrulamak için ekspresyon gösteren bölümleri tanımlamak için bir floresan mikroskop altında. İfadenin soluk olması muhtemeldir. Aşağıdaki protokolü kullanarak florofora karşı immün boyama gerçekleştirin:İkincil bir antikor konakçısının% 10 serumunu içeren 0.5 mL çözeltiye 3 bölüm yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. Bölümleri, başlangıç noktası olarak 1:500 kullanarak 1:250 – 1:1,000 seyreltmede bir birincil antikor çözeltisine aktarın. Birincil antikorlu bölümleri, bir parafin filmi ile kapatılmış bir mikroplaka içinde gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın. % 10 serumda ikincil antikor çözeltisinin oyuğu başına 0.5 mL ekleyin. Oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın. Nükleer leke (örn. DAPI) içeren sulu bir montaj ortamına sahip kızaklara monte edin. Tüm bir bölümün karo taramasını gerçekleştirerek konfokal mikroskop kullanarak lokalizasyonu ve yayılımı değerlendirin. Hedeflenen beyin bölgelerindeki floresan piksel yoğunluğunu ölçerek ekspresyon yoğunluğunu değerlendirin ve intrakraniyal olarak enjekte edilen bir kontrolle karşılaştırın. Alternatif olarak, DAPI pozitif hücrelere veya hücreye özgü belirteçlere kıyasla kemogenetik reseptörlere karşı boyanmış hücreleri sayarak pozitif nöronların yüzdesini değerlendirin. 50 μm’lik kesitte hematoksilen boyama yaparak ve hücre kaybı, hücre kalıntıları birikimi ve diğer ağır hasar belirtileri için görüntüleme yaparak doku hasarını değerlendirin. Hücre hedeflemenin özgüllüğünü değerlendirmek için, kemogenetik reseptör ve hücreye özgü bir belirteç için aşağıda tarif edildiği gibi çift immün boyama gerçekleştirin. Ardından, adım 9.8’deki gibi hücre pozitif sayımları gerçekleştirin.İkincil bir antikor konakçısının% 10 serumunu içeren bir çözeltinin 0.5 mL’sine 3 bölüm yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. Bölümleri, başlangıç noktası olarak 1:500 kullanarak, 1:250 – 1:1,000 seyreltmede bir kemogenetik reseptörün floresan belirtecine karşı bir primer antikor çözeltisine aktarın. Hücreye özgü bir ilgilenilen işaretleyiciye (örneğin, CamkIIa) karşı hedeflenen farklı bir konakçı türden ikinci bir birincil antikor ekleyin. Birincil antikorlu bölümleri, parafin film ile kapatılmış bir mikroplaka içinde gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın. Her iki ikincil antikorun konakçı türlerinin% 10 serumunda ikincil antikor çözeltisinin oyuğu başına 0.5 mL ekleyin.NOT: Her antikorun ayrı bir floroforu olmalı ve adım 9.10.2’deki primer antikorlara karşı reaktif olmalıdır. Oda sıcaklığında 4 saat inkübe edin. Bölümleri PBS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın. Kızaklara monte edin ve nükleer leke içeren sulu bir montaj ortamıyla sabitleyin. 10. c-Fos için immün boyama ile nöronal aktivasyonu değerlendirin Bu protokolün 9.5 maddesinde olduğu gibi, bir c-Fos birincil antikoru ve nükleer boyadan farklı bir floresan etikete sahip ikincil bir antikor kullanarak c-Fos boyaması gerçekleştirin. Kemogenetik bir reseptör tarafından hedeflenen alanda hem c-Fos hem de nükleer leke için pozitif olan hücrelerin yüzdesini sayın. Kemogenetik reseptörleri eksprese eden ve kemogenetik ligand veya araç kontrolü ile tedavi edilen fare grubunda ve kemogenetik ligand veya araç kontrolü ile tedavi edilen vahşi tip fare grubunda c-Fos pozitif çekirdeklerin yüzdesini analiz edin.