Apertura de la barrera hematoencefálica inducida por ultrasonido focalizado para dirigirse a las estructuras cerebrales y evaluar la neuromodulación quimiogenética

Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Tecnología de California, donde los datos fueron obtenidos originalmente por J.O.S. 1. Diseño e impresión 3D de arneses para animales y hardware de guía de imágenes Utilice los archivos del sitio web del laboratorio Szablowski en: https://www.szablowskilab.org/downloads para la impresión 3D de los componentes. Asegúrese de que el material de impresión tenga una baja susceptibilidad en la RMN, pero que tenga un soporte visible para la RMN. Consulte los detalles de los materiales utilizados en la sección de materiales y reactivos. Tenga en cuenta la degradación del material con múltiples usos probando el material repetidamente y observando los sitios de desgaste que deben reforzarse. Asegúrese de que las paredes impresas tengan al menos 2 mm de grosor. Utilice impresoras 3D de alta precisión para mejorar la precisión de la orientación. Contrarreste la gravedad y otras fuerzas para evitar la desviación de los componentes de plástico impresos en 3D apoyando los componentes a lo largo de su longitud y aumentando el grosor de las paredes impresas en 3D si se observa alguna flexión. Tenga en cuenta la precisión en múltiples ejes, incluidos anterior/posterior, medial/lateral, dorsal/ventral, así como guiñada, cabeceo e inclinación. Pruebe la precisión de la orientación realizando FUS-BBBO y registrando la desviación de la posición objetivo. Si utiliza sistemas estereotáxicos motorizados, evalúe los efectos del movimiento dinámico en la elasticidad del material grabando el procedimiento de orientación FUS-BBBO en vídeo y corrija cualquier desviación engrosando las paredes del material impreso en 3D. 2. Descripción del sistema de ultrasonido Utilice un sistema de ultrasonido con un transductor anular de ocho elementos (diámetro = 25 mm, punto focal natural = 20 mm; apertura (F) = 0,8)) y acople la carcasa a la cabeza con gel de ultrasonido desgasificado aplicando gel a la cabeza del ratón afeitado.NOTA: La frecuencia central de un transductor utilizado en un estudio previo7 fue de 1,5 MHz, la duración del pulso fue de 10 ms y la frecuencia de repetición del pulso fue de 1 Hz durante 120 s. Las presiones se calibraron con hidrófono de fibra óptica y se mantuvieron entre 0,36-0,45 MPa. Supongamos una atenuación acústica del 18% a través del cráneo21 para 1,5 MHz y el hueso parietal. La gama de condiciones apropiadas para una apertura segura de BBB y la administración de AAV se han descrito en detalle en otra parte 7,14,22. 3. Preparación animal Anestesiar un ratón mediante inhalación de isoflurano al 2% con aire de grado médico. Verifique la profundidad de la anestesia con un pellizco táctil para confirmar la falta de respuesta. Luego, aplique un ungüento oftálmico para evitar que la córnea se seque usando un hisopo estéril de un solo uso para evitar la contaminación cruzada del tubo de ungüento.NOTA: El procedimiento típico de FUS-BBBO puede oscilar entre 30 minutos y 2 horas, y la anestesia debe mantenerse durante todo el proceso. Después de anestesiar al ratón, lavar un catéter limpio con solución salina heparinizada (10 U/ml).NOTA: Un catéter apropiado para un ratón de 25-35 g tiene una aguja de 30 g y un tubo de PE10. Posteriormente, desinfecte la cola del ratón con una almohadilla de etanol al 70%. Coloque el catéter de la vena de la cola en una vena lateral de la cola y asegúrelo con un pegamento para tejidos. Observe un reflujo de sangre desde la vena de la cola hacia el catéter para confirmar su colocación. Afeita la cabeza del ratón y luego usa crema depilatoria después de que el pegamento tisular se haya secado para reducir la posibilidad de que las burbujas de aire queden atrapadas bajo el gel ultrasónico durante la insonación. Coloque el ratón en un carro de resonancia magnética impreso en 3D, montando los dientes frontales en una barra de mordida y la cabeza dentro de una nariz (Figura 1a). Inyecte hasta 10 μL de lidocaína por vía subcutánea en el sitio que entra en contacto con las barras de las orejas desafiladas. Luego, asegure las barras desafiladas al cráneo y aplique cantidades seguras de presión, teniendo cuidado de no aplicar presión a la tráquea, ya que impide la respiración. Observe la respiración durante 30 s para confirmar que el animal respira libremente a un ritmo de 1/s. Conecte la guía de orientación a las barras de los oídos, verifique la respiración como en el paso 3.6 (Figura 1b) y continúe monitoreando visualmente la respiración durante todo el procedimiento cada minuto. Una frecuencia respiratoria elevada por encima de 1/s es una de las indicaciones de pérdida de anestesia. Continúe monitoreando la respuesta de pellizco de los dedos de los pies cada 5 minutos cuando los ratones no estén en el escáner de resonancia magnética o si la frecuencia respiratoria se eleva por encima de 1/s. Transfiera el carro de resonancia magnética a un soporte de resonancia magnética y luego dentro del orificio de un imán.NOTA: El diseño del hardware está optimizado para una bobina de 72 mm dentro de una resonancia magnética 7T. Adquiera una secuencia de resonancia magnética para localizar el ratón en el escáner. Seleccione la secuencia de disparo rápido de ángulo bajo (FLASH) en 3D para adquirir la totalidad del cerebro, utilizando los siguientes parámetros, de acuerdo con las instrucciones específicas del fabricante del instrumento. Tiempo de eco: 3,9 ms, Tiempo de repetición: 15 ms, Ángulo de pulso de excitación: 15°, Tamaño de la matriz: 130 x 130 x 114, Resolución: 350 x 200 x 200 μm por vóxel, Promedios: 1, Tiempo de adquisición: 3 min 42s Transfiera archivos desde el sistema de resonancia magnética a una computadora que controle el sistema FUS. Abra la secuencia de imágenes en el software para realizar la orientación guiada por RMN, donde debería aparecer la imagen como se muestra en la Figura 1c. 4. Focalización guiada por resonancia magnética NOTA: Con el uso de guías de focalización diseñadas a medida, no es necesario colocar un transductor de ultrasonido dentro de una resonancia magnética, ni es necesario incidir la piel para realizar la focalización mediante la reducción a cero de la estereotasa en las líneas bregma y lambda. Siga los pasos que se indican a continuación para realizar el proceso de segmentación. Coloque el carro dentro de un instrumento estereotáxico. Asegúrelo en su lugar con un bloque de metal con una cinta adhesiva de doble cara y presionando el carro contra dos postes de soporte del instrumento estereotáxico. Transfiera imágenes de resonancia magnética a una computadora con un software de guía FUS en ejecución seleccionando archivos en el administrador de datos, haciendo clic con el botón derecho para abrir las opciones del menú y seleccionando ‘Transferir inmediatamente’. Abra el software de guía FUS y cargue la imagen haciendo clic en ‘Abrir secuencia’ y cargando todos los archivos de la secuencia de imágenes. Vuelva a formatear la imagen a tres ejes presionando el botón derecho y ‘Reformatar’. Localice el transductor en la guía de orientación circular (Figura 1c) haciendo clic con el botón derecho. En la vista sagital, ajuste la posición vertical de un transductor virtual para tener en cuenta el grosor del baño de agua y la carcasa del transductor (en este caso, 8,2 mm hacia arriba, Figura 1d). Señale las áreas a las que se dirigirá en el planificador de trayectorias y anote las coordenadas en una hoja de cálculo (en este caso, el mesencéfalo, como en la Figura 1d). Marque la profundidad deseada de la orientación (valor z en la trayectoria electrónica (Figura 2) y anote las coordenadas en una hoja de cálculo. Apunte a cada uno de los puntos presionando ‘Enviar trayectoria’ y ‘Ejecutar’ (Figura 2).NOTA: Esto se hace cuando se coloca un soporte para mouse dentro de los motores. Sin embargo, se puede lograr la misma orientación con alta precisión en un instrumento estereotáxico. Para correlacionar las coordenadas de una resonancia magnética con el marco estereotáxico, coloque el transductor montado a medida sobre una guía de orientación y traslación hasta que cada uno de los tres pernos de orientación (Figura 3, elemento A) pueda pasar tanto por el soporte del transductor (Figura 3, elemento B) como por la guía de orientación (Figura 3, elemento C). Asegúrese de que los pernos no estén bajo tensión o inclinación. Traslade el transductor 10,56 mm hacia adelante en dirección anterior/posterior hasta que se encuentre en el mismo lugar donde aparece el centro de una guía de orientación en una resonancia magnética. Determine la distancia desde el centro del transductor virtual (Figura 3a, elemento A) hasta la región de destino (Figura 3a, elemento B) y mueva el transductor a estas coordenadas utilizando el marco estereotáxico. Proceda a la preparación de la solución inyectable. 5. Preparación de la solución inyectable NOTA: Las soluciones de microburbujas son muy sensibles a la presión. En consecuencia, la mezcla vigorosa o la inyección rápida a través de agujas finas pueden colapsar las microburbujas y reducir la eficacia de la apertura de la BBB. Además, las microburbujas son más livianas que el agua y pueden flotar hasta la parte superior de un tubo, catéter o jeringa (Figura 4), por ejemplo, en un inyector automático. Se recomienda encarecidamente volver a suspender la solución de microburbujas inmediatamente antes de cada inyección. Extraer 0,8 ml de solución salina con una jeringa en un tubo de 1,5 ml. Con una jeringa, agregue 0.1 ml de agente de contraste para resonancia magnética en el mismo tubo de 1.5 ml y mezcle. Lleve la solución de microburbujas23,24 no activadas a temperatura ambiente. Justo antes de la insonación, active las microburbujas durante 45 s en un dispositivo de activación de microburbujas. Retire lentamente (más de ~ 3 s) 0,1 ml de microburbujas con una jeringa de tuberculina de 1 ml y una aguja de 21 g de la profundidad media de un líquido. Añadir 0,08 ml de microburbujas a la solución de contrastante y solución salina preparada en el paso 5.3. Mezclar dando golpecitos con la mano durante 15 s. Con una concentración final de AAVs de 0,5-2 x10 10 partículas virales por gramo de peso corporal (VP/g), inyectar la carga para su entrega (en este caso AAV9) a través de una aguja de 30 G en el catéter de la vena de cola, en el caso de ATAC – AAVs portadores de receptores quimiogenéticos, o un control negativo, como AAVs portadores de GFP bajo el mismo promotor. Mezcle las microburbujas a mano durante 15 s nuevamente para evitar la flotación (Figura 4). Inmediatamente después, aspire 200 μL de la solución de microburbujas a través de una jeringa sin aguja colocada. La falta de una aguja reducirá las fuerzas de cizallamiento en las microburbujas. Invierta la jeringa y mezcle presionando el émbolo hacia arriba y hacia abajo. Coloque la aguja de 30 G y, mientras aún está invertida, empuje lentamente las microburbujas hasta que aparezcan gotas en el extremo de una aguja. 6. Procedimiento de insonación Ajuste los parámetros para la insonación: duración del pulso de 10 ms, 120 repeticiones, cada s, y presión de 0,30-0,45 MPa en el cráneo. Retire la guía de orientación y aplique gel de ultrasonido desgasificado en la cabeza del ratón, asegurándose de que no se formen burbujas. Baje el transductor y colóquelo directamente en el soporte de la barra de la oreja, y marque las coordenadas en los instrumentos estereotáxicos (Figura 5). Inyectar la solución de AAV (0,5-2 x 1010 VP/g). Mezclar las microburbujas y la solución de contraste para RMN durante 15 s e inyectar 80 μL por ratón de 30 g. Aplique inmediatamente ultrasonido durante 120 s pulsando ‘Enviar’ y ‘Ejecutar’. Si se dirige a más de un sitio, mueva el transductor a ese sitio y ajuste la orientación de profundidad siguiendo los números de la hoja de cálculo de los pasos 4.7-4.9. A continuación, repita los pasos 6.5-6.6 para cada sitio insonado. 7. Evaluación por resonancia magnética de la apertura de la BHE NOTA: La evaluación por RMN de la abertura de la BHE se ha descrito en detalle en otra parte11. La ubicación de la apertura de la BHE se puede visualizar como áreas más brillantes en ratones que recibieron una inyección de un agente de contraste Gd ponderado en T1. Después de la aplicación de ultrasonido, registre una secuencia de resonancia magnética como en el paso 3.10. Retire el ratón del escáner de resonancia magnética y colóquelo en una jaula de recuperación para permitir la recuperación de la anestesia. Monitoree a los ratones diariamente para detectar signos de angustia, pérdida de peso u otros criterios de valoración humanitarios. Consulte al personal veterinario y a las guías institucionales de la IACUC para proceder con cualquier tratamiento en caso de que ocurran eventos adversos inesperados. 8. Estimulación DREADD con un ligando quimiogenético Escoge un receptor quimiogenético. Para los DREADD, elija el receptor hM3Dq para la activación neuronal a través de las vías acopladas a Gq19, el receptor hM4Di para la inhibición de la actividad neuronal a través de las vías acopladas Gi/o20, o el receptor KORD para la activación de las neuronas a través de las vías acopladas a Gs utilizando el ligando25 de Salvinorin-B. Disolver el n-óxido de clozapina (CNO) en solución salina estéril a una concentración de 1 mg/ml. Almacenar el CNO alícuota a -20 °C. Administrar CNO 19, u otro ligando quimiogenético26,27,28, por vía intraperitoneal a concentraciones entre 0,3 –10 mg/kg. Si se van a registrar los efectos de la CNO sobre el comportamiento, se debe comenzar a registrar la actividad conductual dentro de los 15-45 minutos posteriores a la administración del fármaco para lograr la máxima activación de los DREADDs19. Si se desea un análisis de la activación neuronal, utilice ratones para la evaluación histológica después de 60-120 minutos después de la inyección. Proceder a la eutanasia mediante perfusión cardíaca (ver sección 9). 9. Evaluación histológica de la expresión génica y la activación quimiogenética NOTA: Una vez que se alcanza el criterio de valoración experimental (p. ej., fin del estudio conductual, tiempo necesario para la expresión génica), es fundamental confirmar la ubicación y la presencia de la expresión génica. Después de la activación con un ligando quimiogenético, realizar la perfusión cardíaca para preservar los tejidos.Anestesiar al ratón con una mezcla de ketamina (100 mg/kg) / xilacina (10 mg/kg) en solución salina estéril mediante una inyección IP. Confirme la anestesia con un pellizco en el dedo del pie y asegúrese de que la frecuencia respiratoria se haya reducido a aproximadamente 1/s. Proporcionar soporte térmico a través de la almohadilla térmica hasta la confirmación de la eutanasia. Prepare formalina tamponada neutra (NBF) al 10% y PBS con 10 unidades de heparina por ml.NOTA: Las soluciones deben estar a 4 °C. Vierta cada tampón en tubos separados de 50 ml y conéctelos y cebe una bomba peristáltica conectada a un catéter de mariposa de 25 G con solución de PBS/heparina. Sujete las extremidades a una almohadilla azul absorbente con cinta adhesiva y asegúrese de que el animal esté en posición supina sobre la almohadilla. Desinfectar el pelaje para evitar la contaminación cruzada de los órganos periféricos en caso de que sea necesario recogerlos. Abrir la cavidad peritoneal mediante una incisión transversal, exponiendo el diafragma. Abra la caja torácica a través de dos cortes de tijeras quirúrgicas a lo largo del eje anterior / posterior. Exponga el corazón y coloque la aguja en una cavidad izquierda (lado derecho del corazón visto en decúbito supino) y colóquela en el catéter de mariposa en el paso 9.1.3. Haga una pequeña incisión en el ventrículo derecho para permitir la salida de la sangre. Encienda la bomba peristáltica para comenzar a eliminar la sangre con PBS/heparina.NOTA: Si este paso no se realiza adecuadamente, la sangre se coagulará durante la fijación con formol e impedirá la perfusión adecuada. Después de que se haya eliminado toda la sangre y comience a salir PBS claro del ventrículo derecho, cambie la entrada de una bomba peristáltica a una solución NBF y comience la perfusión durante 25 ml por ratón. Extraer el cerebro, colocar en al menos 4 mL de NBF y posfijar durante 24 h. Seccionar el cerebro usando secciones coronales en un vibrátomo usando un espesor de sección de 50 μm. Coloque cada sección en un pocillo de una placa de 24 pocillos que almacene las secciones en todo el cerebro. Evaluar la expresión de los receptores quimiogenéticos fusionados a proteínas fluorescentes (p. ej., mCherry o mCitrine), bajo un microscopio fluorescente para identificar las secciones que muestran expresión y confirmar la ubicación. Es probable que la expresión sea tenue. Realice la inmunotinción contra el fluoróforo utilizando el siguiente protocolo:Colocar 3 secciones en 0,5 ml de solución que contenga un 10% de suero de un huésped de un anticuerpo secundario e incubar durante 30 min. Transfiera las secciones a una solución de un anticuerpo primario con una dilución de 1:250 a 1:1.000, utilizando 1:500 como punto de partida. Incubar las secciones con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C en una microplaca sellada con una película de parafina. Lave las secciones con PBS, 3 veces durante 5 minutos a la vez. Añadir 0,5 ml por pocillo de la solución de anticuerpos secundarios en suero al 10%. Incubar durante 4 h a temperatura ambiente. Lave las secciones con PBS, 3 veces durante 5 minutos a la vez. Móntelo en portaobjetos con un medio de montaje acuoso que contenga una tinción nuclear (p. ej., DAPI). Evalúe la localización y la propagación con un microscopio confocal realizando un escaneo de mosaico de una sección completa. Evalúe la intensidad de la expresión midiendo la intensidad de los píxeles de fluorescencia en regiones cerebrales específicas y compárelo con un control inyectado intracranealmente. Alternativamente, evalúe el porcentaje de neuronas positivas contando las células teñidas contra receptores quimiogenéticos, en comparación con las células DAPI positivas o marcadores específicos de la célula. Evalúe el daño tisular realizando tinción con hematoxilina en una sección de 50 μm y la obtención de imágenes para detectar la pérdida de células, la acumulación de restos celulares y otros signos de daño grave. Para evaluar la especificidad de la diana celular, realice una inmunotinción doble como se describe a continuación para el receptor quimiogenético y un marcador específico de la célula. A continuación, realice recuentos de células positivas como en el paso 9.8.Colocar 3 secciones en 0,5 ml de una solución que contenga un 10% de suero de un huésped de un anticuerpo secundario e incubar durante 30 min. Transfiera las secciones a una solución de un anticuerpo primario contra un marcador fluorescente de un receptor quimiogenético con una dilución de 1:250 a 1:1.000, utilizando 1:500 como punto de partida. Agregue un segundo anticuerpo primario de una especie huésped diferente que se dirija contra un marcador de interés específico de la célula (por ejemplo, CamkIIa). Incubar las secciones con el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C en una microplaca sellada con una película de parafina. Lave las secciones con PBS, 3 veces durante 5 minutos a la vez. Añadir 0,5 ml por pocillo de solución de anticuerpos secundarios en suero al 10% de la especie huésped de ambos anticuerpos secundarios.NOTA: Cada anticuerpo debe tener un fluoróforo distinto y debe ser reactivo contra los anticuerpos primarios en el paso 9.10.2. Incubar durante 4 h a temperatura ambiente. Lave las secciones con PBS, 3 veces durante 5 minutos a la vez. Móntelo en portaobjetos y fíjelo con un medio de montaje acuoso que contenga una tinción nuclear. 10. Evaluar la activación neuronal con inmunotinción para c-Fos Realice la tinción de c-Fos como en el punto 9.5 de este protocolo utilizando un anticuerpo primario de c-Fos y un anticuerpo secundario con una etiqueta fluorescente distinta de la tinción nuclear. Cuente el porcentaje de células que son positivas tanto para c-Fos como para tinción nuclear en el área objetivo de un receptor quimiogenético. Analizar el porcentaje de núcleos positivos de c-Fos en un grupo de ratones que expresan receptores quimiogenéticos y tratados con un ligando quimiogenético o control de vehículo y en un grupo de ratones de tipo salvaje que son tratados con un ligando quimiogenético o un control de vehículo.