מוצג כאן פרוטוקול עבור זיהום Pseudomonas aeruginosa ויישום טיפול phage בעוברי דגי זברה סיסטיק פיברוזיס (CF).
עמידות מיקרוביאלית, תוצאה גדולה של אי-ודאות אבחונית ויתור יתר מיקרוביאלי, היא גורם מוכר יותר ויותר לזיהומים חמורים, סיבוכים, ותמותה ברחבי העולם עם השפעה עצומה על החברה שלנו ועל מערכת הבריאות. בפרט, חולים עם מערכות חיסוניות בסכנה או פתולוגיות קיימות וכרוניות מראש, כגון סיסטיק פיברוזיס (CF), נתונים לטיפולים אנטיביוטיים תכופים כדי לשלוט בזיהומים עם המראה ופיזור של מבודדים עמידים multidrug. לכן, יש צורך דחוף לטפל טיפולים חלופיים כדי לנטרל זיהומים חיידקיים. שימוש bacteriophages, האויבים הטבעיים של חיידקים, יכול להיות פתרון אפשרי. הפרוטוקול המפורט בעבודה זו מתאר את היישום של טיפול phage נגד זיהום aeruginosa פסאודומונס בעוברי דגי זברה CF. עוברי דגי זברה נדבקו P. aeruginosa כדי להוכיח כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa כפי שהוא מפחית קטלניות, נטל חיידקי ותגובה חיסונית פרו דלקתית בעוברי CF.
טיפול Phage, השימוש באויבים הטבעיים של חיידקים להילחם בזיהומים חיידקיים, הוא צובר עניין מחודש כמו עמידות חיידקים לאנטיביוטיקה הופךנפוץ 1,,2. טיפול זה, המשמש במשך עשרות שנים במזרח אירופה, יכול להיחשב טיפול משלים לאנטיביוטיקה בריפוי דלקות ריאות בחולים עם CF וחלופה טיפולית אפשרית עבור חולים נגועים בחיידקים עמידים בפני כל הנוכחי בשימושבאנטיביוטיקה 2,3. היתרונות של טיפול אנטיביוטי הם bacteriophages להכפיל באתר הזיהום, בעוד אנטיביוטיקה הם מטבוליזם ומבוטלמהגוף 4,5. אכן, ניהול קוקטיילים של phages ארסי מבודד במעבדות שונות הוכיח להיות יעיל בטיפול בזיהומים aeruginosa פסאודומונס במודלים של בעלי חיים שונה כמו חרקים ויונקים6,7,8. טיפול Phage הוכח גם להיות מסוגל להפחית את הנטל החיידקי בפצעי כוויות נגוע P. aeruginosa ו Escherichia קולי בניסוי קליני אקראי9.
דגי זברה (דניו rerio) לאחרונה התגלה כמודל יקר לחקר זיהומים עם מספר פתוגנים, כולל P. aeruginosa10,,11, מורסה Mycobacterium ו Burkolderia cepacia12,13. על ידי microinjecting חיידקים ישירותלתוך מחזור הדם העובר 14 קל להקים זיהום מערכתי כי הוא מנוטרל על ידי מערכת החיסון המולדת של דגי הזברה, אשר אבולוציונית שמר עם נויטרופילים ודור מקרופאג דומה המקביל האנושי. יתר על כן, במהלך החודש הראשון של החיים, עוברי דגי זברה חסרים את התגובה החיסונית אדפטיבית, מה שהופך אותם מודלים אידיאליים ללימוד החסינות המולדת, שהוא מנגנון ההגנה הקריטי בדלקותריאות אנושיות 15. דגי זברה הופיעו לאחרונה כמערכת מודל גנטי רב עוצמה כדי להבין טוב יותר את תחילת CF ולפתח טיפוליםתרופתיים חדשים 10,16,17. מודל דגי הזברה CF של CFTR נוק-דאון שנוצר עם הזרקת מורפולינו בדעי זברה הציג תגובה התפרצות נשימתית לחה והגירהנויטרופיל מופחתת 10, בעוד נוק אאוט CFTR מוביל לתום איברים פנימי לקוי והרס של הלבלב האקסוקריני, פנוטיפהמשקף מחלה אנושית 16,17. העניין הגדול ביותר היה הממצא כי הנטל החיידקי P. aeruginosa היה גבוה באופן משמעותי בעוברים cftr-אובדן של פונקציה מאשר בפקדים ב 8 שעות לאחר הזיהום (hpi), אשר מקביל את התוצאות שהתקבלו עם עכברים ותאי אפיתל הסיפונותהאנושיים 2,,18.
בעבודה זו, אנו מדגימים כי טיפול phage יעיל נגד P. זיהומים aeruginosa בעוברי דגי זברה.
בכתב יד זה, תיארנו את הפרוטוקול לבצע P. aeruginosa (PAO1) זיהום בעוברי דגי זברה ואיך ליישם טיפול phage עם קוקטייל של phages שזוהו בעבר כמסוגל להדביק PAO1 כדי לפתור את זה. השימוש bacteriophages כחלופה לטיפולים אנטיביוטיים כבר עניין גובר מאז השנים האחרונות. זה בעיקר בשל דיפוזיה של זיהומים חיידקיים עמידים לתרו?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן סיסטיק פיברוזיס האיטלקית (FFC#22/2017; אסוציאציה “גלי אצ’י דלה ריטי” קסניגו ו-FFC#23/2019; האו”ם respiro בפיו Onlus La Mano tesa Onlus).
Bacto Agar | BD | 214010 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Stereomicroscope | Leica | S9I | |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |