Фаг терапии Применение для противодействия Pseudomonas aeruginosa инфекции в муковисцидоз Зебрафиш Эмбрионы
Summary
Представлено здесь протокол для Pseudomonas aeruginosa инфекции и фаг терапии применения в муковисцидоз (CF) эмбрионов зебры.
Abstract
Устойчивость к противомикробным препаратам, которое является одним из основных следствий диагностической неопределенности и чрезмерной предписания противомикробных препаратов, является все более признанной причиной тяжелых инфекций, осложнений и смертности во всем мире, что оказывает огромное воздействие на наше общество и систему здравоохранения. В частности, пациенты с ослабленной иммунной системой или уже существующими и хроническими патологиями, такими как муковисцидоз (CF), подвергаются частым антибиотикам для борьбы с инфекциями с появлением и распространением мультирезистентных изолятов. Поэтому существует настоятельная необходимость в решении альтернативных методов лечения для противодействия бактериальным инфекциям. Использование бактериофагов, естественных врагов бактерий, может быть возможным решением. Протокол, подробно описанный в этой работе, описывает применение фаговой терапии против инфекции Pseudomonas aeruginosa в эмбрионах зебры. Эмбрионы зебры были инфицированы P. aeruginosa, чтобы продемонстрировать, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa, поскольку она снижает летальность, бактериальное бремя и провоспалительный иммунный ответ в эмбрионах CF.
Introduction
Фаге терапии, использование естественных врагов бактерий для борьбы с бактериальными инфекциями, набирает новый интерес, как бактериальная устойчивость к антибиотикамстановится широко распространенным 1,2. Эта терапия, используемая в течение десятилетий в Восточной Европе, можно считать дополнительным лечением антибиотиков в лечении легочных инфекций у пациентов с CF и возможной терапевтической альтернативой для пациентов, инфицированных бактериями, которые устойчивы ко всем используемым в настоящее времяантибиотикам 2,3. Преимущества антибиотикотерапии в том, что бактериофагы размножаются на месте инфекции, в то время как антибиотики метаболизируются ивыбывают из организма 4,,5. Действительно, администрирование коктейлей вирулентных фагов, изолированных в различных лабораториях, оказалось эффективным в лечении инфекций Pseudomonas aeruginosa в животных моделях, таких как насекомыеи млекопитающие 6,7,8. Фаге терапии было также показано, чтобы быть в состоянии уменьшить бактериальную нагрузку в ожоговых ран, инфицированных P. aeruginosa и Escherichia coli в рандомизированных клиническихиспытаний 9.
Зебрафиш(Danio rerio) недавно стала ценной моделью для изучения инфекций с несколькими патогенами, в том числе P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus и Burkolderia cepacia12,13. Путем микроинъекций бактерий сразу вциркуляцию крови зародыша 14 легко установить системную инфекцию которая противодействована зебрафиш врожденной иммунной системой, которая эволюционирована сохранена с нейтрофилами и поколением макрофагов подобно к людским двойнику. Кроме того, в течение первого месяца жизни эмбрионы зебры не имеют адаптивного иммунного ответа, что делает их идеальными моделями для изучения врожденного иммунитета, который является критическим защитным механизмом в легочныхинфекциях человека 15. Зебрафиш недавно появилась как мощная генетическая модель системы, чтобы лучше понять начало CF и разработать новыефармакологические методы лечения 10,,16,17. CF зебрафиш модель cftr нокдаун генерируется с морфолино инъекции в зебрафиш представил смоченной реакции респираторного всплеска и снижениемиграции нейтрофилов 10, в то время как cftr нокаут приводит к нарушению внутреннего положения органа и разрушение экзокринной поджелудочной железы, фенотип, которыйотражает болезни человека 16,17. Наибольший интерес представляет вывод о том, что бактериальная нагрузка P. aeruginosa была значительно выше в cftr-потеря-функции эмбрионов, чем в контроле на 8 часов после заражения (hpi), который параллели результаты, полученные с мышами и человека бронхиальных эпителиальныхклеток 2,18. cftr
В этой работе мы демонстрируем, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa у эмбрионов зебры.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой рукописи мы описали протокол для выполнения P. aeruginosa (PAO1) инфекции в эмбрионах зебры и как применять фаг терапии с коктейлем фагов ранее определены как способные заразить PAO1, чтобы решить ее. Использование бактериофагов в качестве альтернативы лечению антибиотиками представ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Итальянским фондом муковисцидоза (FFC No22/2017; Ассоциазионе “Gli amici della Ritty” Casnigo и FFC No23/2019; Un respiro в Пио Онлус Ла Мано теса Онлус).
Materials
| Bacto Agar | BD | 214010 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | 289329 | |
| Dulbecco's phospate buffered saline PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 886-86-2 | common name tricaine |
| Femtojet Micromanipulator | Eppendorf | 5247 | |
| Fleming/brown P-97 | Sutter Instrument Company | P-97 | |
| LE-Agarose | Sigma-Aldrich | 11685660001 | |
| Low Melting Agarose | Sigma-Aldrich | CAS 9012-36-6 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Methyl Blue | Sigma-Aldrich | 28983-56-4 | |
| Microinjection needles | Harvard apparatus | ||
| N-Phenylthiourea >=98% | Aldrich-P7629 | 103-85-5 | |
| Oligo Morpholino | Gene Tools | designed by the researcher | |
| PEG6000 | Calbiochem | 528877 | |
| Phenol Red Solution | Sigma-Aldrich | CAS 143-74-B | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Pronase | Sigma-Aldrich | 9036-06-0 | |
| Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0% | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Stereomicroscope | Leica | S9I | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Triton X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| Tryptone | Oxoid | LP0042B | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021B | |
| Z-MOLDS Microinjection | Word Precision Instruments |
References
- Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
- Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
- Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
- Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
- Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
- Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
- McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
- Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
- Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
- Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
- Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
- Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
- Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
- Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer’s vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
- Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
- Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
- Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
- Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).
